Identifisering av multiresistente og β-laktamaseproduserende bakterier (ESBL og karbapenemaser) isolert fra vasket og spiseklar salat ved bruk av fenotypiske og genotypiske metoder

Abstract

Bakgrunn: Økningen av antibiotikaresistente bakterier er et stort og alvorlig problem som truer den globale folkehelsen. Økningen av multiresistente bakterier truer behandlingsmulighetene for infeksjoner i fremtiden. Mat er en potensiell spredningsvei for antibiotikaresistens, og forståelse og kunnskap om utbredelse og spredningsvei for antibiotikaresistens er viktig for å kunne sette i gang effektive tiltak for å hindre utvikling og videre spredning av antibiotikaresistens.

Hensikt: Hensikten med denne oppgaven er å undersøke utbredelsen av antibiotikaresistens-gener hos bakterier isolert fra salat som selges på det norske markedet, samt tilstedeværelsen av β-hemolytiske bakterier som en indikasjon på mulig patogene bakterier. Metode: Tre importere «vasket og spiseklar» salater ble undersøkt i denne studien. Selektive kromogene medier ble brukt for å dyrke frem bakterier med ESBL- og KRE-fenotypisk resistens. Blodagar ble brukt for påvisning av β-hemolyserende bakterier. Sangersekvensering av 16S rRNA ble brukt for identifisering av bakterieslekt av bakteriekoloniene fra selektive kromogene medier og blodagar. Multipleks PCR ble brukt for å screene etter utvalgte resistensgener. Det ble brukt primerpar rettet mot de mest utbredte ESBLA- og ESBLKARBA-genene. Agarose gelelektroforese ble brukt for visualisering av eventuelle funn. Tre interessante bakteriestammer ble helgenomsekvensert med Illumina Miseq. Helgenomsekvensering ble brukt for artsbestemmelse av bakterien ved bruk av rMLST, samt påvisning av en gener for antibiotika-, metall- og desinfeksjonsmiddelresistens og gener for virulens.

Resultater: Isolatene fra ESBL-medium ble identifisert som Pseudomonas spp. og Achromobacter spp. Isolatene fra CRE-medium ble identifisert som Stenotrophomonas spp. β-hemolyserende isolater fra blodagar ble identifisert som Bacillus spp. og Aeromonas spp. Multipleks ESBL og multipleks CRE påviste ingen ESBL- eller KRE-gener. En stamme Stenotrophomonas, Achromobacter og Aeromonas ble helgenomsekvensert og artsbestemt som Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter arsenitoxydans og Aeromonas salmonicida. Disse tre stammene, i tillegg til en stamme av Bacillus spp. og Pseudomonas spp. ble følsomhetstestet, alle hadde fenotypisk multiresistens. Genene aph(3 ́)-IIc, aph(6)-Ic, blaL1 og blaL2 ble påvist S. maltophilia. Genene ampC, abaF, macA og macB ble påvist i A. arsenitoxydans. aac(6 ́), abaF, ampC, blaOXA, blaFOX-4 og cphA ble påvist i A. salmonicida. OXA-genet som ble påvist var en helt ny variant. I tillegg ble gener som koder for en rekke multiresistens efflux- system påvist hos de tre stammene. Det ble også påvist en rekke virulensgener assosiert med invasjon og infeksjon.

Konklusjon: I denne studien ble det påvist multiresistente bakterier i vasket og spiseklar salat som selges på det norske markedet. Det ble påvist en helt ny variant av OXA β-laktamase hos A. salmonicida.

Background: The increase in prevalence of antibiotic resistant bacteria is an emerging problem that threatens the global public health. The rise of multidrug resistant bacteria is threatening the future treatment of infections. Food is a potential route for spread of antibiotic resistance. Knowledge of the prevalence and pathway for antibiotic resistance is important to be able to initiate effective measures to prevent development and further spread of antibiotic resistance. Purpose: The purpose of this master thesis was to investigate the prevalence of antibiotic resistance genes in bacteria isolated from ready-to-eat salad sold on the Norwegian market, as well av the presence of β-hemolytic bacteria as an indication of possible pathogenic bacteria. Method: Three imported ready-to-eat salad was examined in this thesis. Selective chromogenic media was used to grow and differentiate bacteria with ESBL- and CRE-phenotype. Blood agar was used to detect β-hemolytic bacteria. Sanger sequencing of 16S rRNA was used in identification of bacteria genus. Multiplex PCR and agarose gel electrophoresis was used in screening of ESBL and CRE resistance genes. Three isolates were sequenced using Illumina Miseq for detection of genes encoding resistance for antibiotics, metal and disinfectants. Genes encoding virulence were also included. Species of the isolates were detected using rMLST. Results: Isolates from ESBL-medium was identified as Pseudomonas spp. and Achromobacter spp. Isolates from CRE-medium was identified as Stenotrophomonas spp. β-hemolytic bacteria was identified as Bacillus spp. and Aeromonas spp. A strain of Stenotrophomonas, Achromobacter and Aeromonas were whole-genom sequenced with Illumina Miseq, and identifies as Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter arsenitoxydans and Aeromonas salmonicida. There three strains, in addition to a strain of Bacillus spp. and Pseudomonas spp. were susceptibility-tested, all with phenotypic multidrug resistance. The genes aph(3')-IIc, aph(6)-Ic, blaL1 and blaL2 were detected in S. maltophilia. The genes ampC, abaF, macA and macB were detected in A. arsenitoxydans. aac(6'), abaF, ampC, blaOXA, blaFOX-4 and cphA were detected in A. salmonicida. The OXA-gene was a new variant that hasn ́t been detected before. In addition, genes encoding a variety of multidrug resistance efflux systems were detected in all three strains, and virulence genes associated with invasion and infection. Conclusion: In this study, multidrug resistant bacteria were found in ready-to-eat salad sold on the Norwegian marked. A new variant of OXA β-lactamase was detected in A. salmonicida.