Videreutvikling av metode for fast-fase ekstraksjon (SPE) av mono-, di- og triacylglyseroler ved bruk av automatisert SPE

Abstract

Formålet med denne masteroppgaven var å utvikle en separasjonsmetode for å separere mono-, di- og triacylglyseroler (MAG, DAG og TAG) ved hjelp av automatisert fast-fase ekstraksjon (SPE). Fettsyresammensetningen av MAG, etter enzymatisk fordøying av TAG, er et av fokusområdene i en ny stipendiatstilling ved Norges miljø- og biovitenskapelige universitet. En SPE-metode som gir grunnlinjeseparasjon av MAG, DAG og TAG vil forenkle prøvebearbeiding i dette prosjektet.

En tidligere etablert seperasjonsmetode som benyttet normalfasesystem med aminopropylkolonne ble reprodusert. Basert på resultatene fra dette ble det brukt iterativ tilnærming for videreutvikling av separasjonsmetoden. Parametere som ble testet var: elueringsmiddel for TAG, fraksjoneringsmønster, elueringsvolum for TAG og DAG, total lipidmasse påsatt SPE, blandingsforholdet mellom acylglyserolene og elueringshastighet. Etter SPE ble fraksjonene metylert og analysert på GC-MS.

Gitt en blanding med likt forhold mellom MAG, DAG og TAG ble det utviklet en separasjonsmetode som ga ≥99% renhet for alle fraksjonene. Metoden var imidlertid avhengig av blandingsforholdet mellom acylglyserolene, og videre testing ble utført. Det ble utviklet en ny metode som ga god separasjon for tre av fire prøver med ulikt blandingsforhold. Metoden ble deretter testet på to kolonnepartier, med ulikt resultat. Flere fraksjoner økte krysskontamineringen med 10 prosentpoeng, mens én gikk ned 23 prosentpoeng. Relativt store variasjoner mellom analysene kan tyde på mangel av reproduserbarhet mellom produksjon av forskjellige kolonnepartier. Før det kan konkluderes om separasjonsmetoden kan benyttes, bør metoden testes på flere partier av SPE-kolonner.

The purpose of this thesis was to develop a separation method for separating mono-, di- and triacylglycerols (MAG, DAG and TAG) by using automated solid-phase extraction (SPE). The fatty acid composition of MAG, after enzymatic digestion of TAG, is one of the focus areas in a project for a new PhD-student at the Norwegian University of Life Sciences. A SPE method that provides baseline separation of MAG, DAG and TAG will simplify sample processing in this project.

A previous separation method using normal phase system with aminopropyl column was reproduced. Based on these results, an iterative approach was used for further development of the separation method. Parameters tested were: TAG eluent, fractionation pattern, TAG and DAG elution volume, total lipid mass loaded onto the SPE columns, acylglycerol mixture ratio, and elution rate. After SPE, the fractions were methylated and analyzed on GC-MS.

Given a mix with equal amounts of MAG, DAG and TAG, a separation method with ≥99% purity of all fractions was developed. However, the method was dependent on the mixing ratio of the acylglycerols, and further testing was performed. A new method was developed which provided good separation for three out of four samples with different mixing ratios. The method was then tested on two column lots, with various results. Several fractions increased the cross contamination by 10 percentage points, while one decreased by 23 percentage points. Relatively large variations between the analyses may indicate a lack of lot-to-lot reproducibility. Before it can be concluded whether the separation method can be used, the method should be tested on several batches.