Droplet digital PCR kvantifisering av fire kandidat sirkulerende miRNA hos kvinner med og uten høygradig cervikal intraepitelial neoplasi (CIN2+)

Abstract

Persisterende infeksjon med humant papillomavirus (HPV) kan føre til utvikling av forstadier til livmorhalskreft (cervikal intraepitelial neoplasi (CIN)) og livmorhalskreft. På verdensbasis er livmorhalskreft den tredje mest diagnostiserte kreftformen blant kvinner, og den mest vanlige HPV-relaterte kreftformen. Innføring av screeningprogram har ført til en betraktelig nedgang i forekomsten av livmorhalskreft. I dag koniseres kvinner som ved screening får påvist høygradig HPV-assosiert CIN i livmorhalsen, selv om lesjonene i de fleste tilfeller vil gå i regress. Nåværende tester klarer ikke å fastslå hvilke kvinner som har høyere risiko for å utvikle livmorhalskreft, noe som resulterer i overbehandling. Selv om konisering er avgjørende for å forebygge kreftutvikling, kan inngrepet medføre komplikasjoner for kvinnen ved svangerskap. Det er et stort behov for progresjonsmarkører som kan optimalisere dagens screening og redusere overbehandling.

Cellefrie sirkulerende mikroRNA (miRNA) i plasma eller serum har fått en økende oppmerksomhet for deres potensiale som biomarkører. MiRNA er små ikke-kodende RNA molekyler som fungerer som posttranskripsjonelle regulatorer ved å binde seg til mRNA med komplementær sekvens. De spiller en avgjørende rolle i regulering av genuttrykk og kontroll av cellulære og metabolske veier hos mennesker. I flere krefttyper, inkludert livmorhalskreft, er det observert endret genuttrykk av miRNA gjennom karsinogenesen, noe som tyder på at de har et potensial som biomarkører for kvinner med forstadier til livmorhalskreft og livmorhalskreft.

Hensikten med denne studien var å undersøke om nivå av fire kandidat sirkulerende miRNA identifisert i serum i en pre-screeningstudie; miR-142-5p, miR-423-5p, miR-451a og miR-29c-3p, korrelerte med ulike lesjonsgrader i livmorhalsen hos kvinner. Endring i genuttrykk vil kunne indikere deres potensiale som biomarkører for identifisering og prognose av kvinner med ulike grader av lesjoner i livmorhalsen, fra lavgradige lesjoner (CIN1), til høygradige lesjoner (CIN2+, som består av kvinner diagnostisert med CIN2, CIN3, adenokarsinoma in situ (ACIS) eller kreft). Disse ble validert i en kohort bestående av serumprøver fra 280 kvinner henvist til gynekolog etter unormale funn ved cytologiscreening. Blant de 280 kvinnene var det 85 som hadde normale funn i livmorhalsen, og 37, 30, 120, 5 og 3 som var diagnostisert med henholdsvis CIN1, CIN2, CIN3, ACIS og kreft. Mengde sirkulerende miRNA i serumprøvene ble kvantifisert med Droplet digital PCR. Resultatene viste at konsentrasjonen (kopier/ul serum) av alle de fire sirkulerende miRNA typene var omvendt assosiert med alvorlighetsgrad av lesjoner i livmorhalsen. Nedreguleringen var signifikant for miR-423-5p (p = 0.008), miR-142-5p (p = 0.020), og miR-29c-3p (p = 0.024), mens den var like under 95 % signifikansnivå for miR-451a (p = 0.078). En sammenslåing av data fra ulike pasientgrupper viste at konsentrasjonen av alle fire miRNA typene var signifikant lavere hos kvinner med CIN2+ og CIN3+ (CIN3, ACIS eller kreft). Det ble ikke identifisert absolutte nivåer av de fire miRNA typene, alene eller i kombinasjon, som med høy presisjon kunne diskriminere kvinner med CIN2+ eller CIN3+ fra kvinner med lavgradige eller ingen lesjoner. Ytterligere forskning som inkluderer flere kohorter i longitudinelle studier, samt flere livmorhalskreftpasienter, vil være nødvendig for å undersøke potensialet de ulike typene sirkulerende miRNA har som biomarkører for prognose av kvinner med CIN1 eller CIN2+, eller tilbakefallsrisiko hos kvinner behandlet for høygradige lesjoner i livmorhalsen.

Persistent infection with human papillomavirus (HPV) may lead to the development of cervical cancer precursors (cervical intraepithelial neoplasia (CIN)) and cervical cancer. Worldwide, cervical cancer is the third most widely diagnosed cancer among women, and the most common HPV-related cancer. The introduction of screening programs has led to a significant decrease in the incidence of cervical cancer cases. Today, women diagnosed with high-grade HPV-associated CIN during screening undergoes conization, although lesions in most cases will regress. Current tests are unable to determine which women that are at higher risk of developing cervical cancer, resulting in overtreatment. Although conization is essential to prevent cancer development, the procedure can lead to complications for women during pregnancy. There is a need for progression markers for optimizing today’s screening and thus reduce overtreatment.

Cell-free circulating microRNA (miRNA) in plasma or serum have received increasing attention due to their potential as biomarkers. MiRNA are small non-coding RNA molecules that act as post-transcriptional regulators by binding to mRNA with sequence complementarity. They play a crucial role in the regulation of gene expression and control of cellular and metabolic pathways in humans. In several cancer types, including cervical cancer, altered gene expression of miRNA has been observed through carcinogenesis, suggesting that they have a potential as biomarkers in women with cervical precursor lesions and cervical cancer.

The purpose of this study was to investigate whether the levels of four candidate circulating miRNAs identified in serum in a pre-screening study; miR-142-5p, miR-423-5p, miR-451a and miR-29c-3p, correlated with different degrees of cervical lesions in women. Altered gene expression could indicate their potential as biomarkers for identification and prognosis of women with different cervical lesions, ranging from low grade lesions (CIN1) to high grade lesions (CIN2+, which consist of all women diagnosed with CIN2, CIN3, adenocarcinoma in situ (ACIS) or cancer). These were validated in a cohort consisting of serum samples from 280 women referred to a gynecologist due to abnormal cytological findings during screening. Among the 280 women, 85 had no cervical lesion, and 37, 30, 120, 5 and 3 were diagnosed with CIN1, CIN2, CIN3, ACIS and cancer, respectively. The level of circulating miRNA in the serum samples was quantified with Droplet digital PCR. The results showed that the concentration (copies/µl serum) of each of the four circulating miRNAs tested was inversely associated with the cervical lesion severity. The down regulation was significant for miR-423-5p (p = 0.008), miR-142-5p (p = 0.020) and miR-29c-3p (p = 0.024), whereas for miR-451a (p = 0.078) it was just under the 95 % significance level. When combining data from different patient groups, the concentration of each of the four miRNA types was significantly lower in women with CIN2+ and CIN3+ (CIN3, ACIS or cancer). No absolute levels were identified for any of the miRNAs alone or in combination, that with high precision could discriminate women with CIN2+ or CIN3+ from women with low grade or no cervical lesion. Further research including more cohorts in longitudinal studies, as well as more cervical cancer patients, will be needed to investigate the potential of the various types of circulating miRNAs as biomarkers for the prognosis of women with CIN1 or CIN2+, or recurrence risk in women treated for high grade cervical lesions.