Target prediction and functional validation of MicroRNA for coagulation factor V and TFPI in liver cancer

Abstract

Background: The connection between cancer and increased risk of thrombosis is well established and liver cancer (HCC) patients have been found to have an increased risk of thrombosis. microRNAs (miRNA) are post-transcriptional gene regulators and their dysregulation have been linked to both HCC progression and thrombosis. Coagulation factor V (FV encoded by F5 gene) and Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI encoded by TFPI-1 gene) have both been linked to cancer progression, with their specific roles in liver cancer yet to be determined. The proteins have also been found to interact in plasma in both healthy and diseased individuals. Until now, two miRNAs have been identified as regulators of TFPI, while none have been identified for FV. Thus, this thesis aimed to identify novel miRNA regulators for FV and TFPI and assess their potential prognostic implications in liver cancer. Methods: In silico selection of candidate miRNAs: miRNAs targeting F5 3’untranslated region (UTR) and TFPI 3’UTR were identified using computational analysis. miRNAs with negative correlation to F5 expression in a breast cancer cohort (OsloII study) were also included in this study. In vitro analysis of miRNAs: Transient overexpression and inhibition of the respective miRNAs was achieved by transfection of miRNA mimics and inhibitors. Direct targeting of F5 3’UTR was determined by luciferase reporter assay in HEK293T cells. The effect of overexpression of the miRNAs on endogenous F5 and TFPI mRNA levels were determined by qRT-PCR and on secreted FV and TFPIalpha protein levels by ELISA in HepG2 cells. Functional effects of overexpression of the miRNAs on apoptosis and viability were determined with an ELISA cell death detection kit and Wst-1 assay, respectively. Clinical significance of the miRNAs was assessed by analysing their expression levels correlated with outcome in liver cancer patients using Kaplan-Meier survival analysis. Expression analysis of miRNAs in tumour versus healthy liver tissue were performed in KM plotter. Results: Computational analysis of F5 3’UTR identified binding sites for 12 miRNAs. Out of these, eight had additional bindings sites in TFPI 3’UTR. In addition, seven miRNAs negatively correlated with F5 in breast cancer cohort (OsloII cohort) were identified with predicted binding sites in 3’UTR of both genes. In total, 19 miRNAs were selected for validation in this study. We found six miRNAs (miR-323a-3p, miR-568, miR-643, miR-651-3p, miR-1236-3p and miR-1278) that directly targeted the F5 3’UTR and significantly downregulated F5 mRNA and FV protein level in HepG2 cells. We also found one miRNA (miR-7-5p) that downregulated TFPIalpha mRNA and TFPIalpha protein level in HepG2 cells. All seven validated miRNAs impaired proliferation of HepG2 cells. Inhibition of miR-568 significantly increased the proliferation. Overexpression of miR-7-5p, miR-323a-3p and miR-1236-3p promoted apoptosis. High expression of miR-568, miR-643, miR-651-3p, miR-1236-3p and miR-1278 was associated with a significant increased estimated survival time in liver cancer patients. Conversely, low miR-7-5p and miR-323a-3p was associated with significantly increased survival time in liver cancer patients. Conclusion: This study demonstrated that FV expression is directly regulated by six miRNAs in liver cancer. In addition, we also demonstrate that TFPIalpha expression is directly regulated by miR-7-5p in liver cancer. Future studies are necessary to further investigate the potential consequences of dysregulation of these miRNAs in relation to both the procoagulant state induced by HCC cells and liver cancer progression.

Bakgrunn: Sammenhengen mellom kreft og en økt risiko for å utvikle tromboembolisk sykdom er veletablert og det er vist at leverkreftpasienter (HCC) har en økt risiko for å få tromboser. MicroRNA (miRNA) er post-transkripsjonelle genregulatorer og deres feilregulering har blitt knyttet til både progresjon av HCC og trombose. Koagulasjonsfaktor V (F5 genet koder for FV) og Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI-1 genet koder for TFPI) har begge blitt knyttet til kreftprogresjon, mens deres spesifikke rolle ved leverkreft enda ikke har blitt fullstendig kartlagt. Proteinene har også blitt funnet å interagere i plasma hos både friske og syke individer. Inntil nå har bare to miRNA blitt identifisert som regulatorer av TFPI, mens ingen har blitt funnet for FV. Dermed var målet for denne oppgaven å identifisere miRNA som regulerer FV og TFPI, og vurdere deres potensielle prognostiske betydning ved leverkreft. Metode: In silico valg av miRNA-kandidater: miRNA som binder til F5 3’ikke translatert region (UTR) og TFPI 3’UTR ble identifisert ved bruk av beregningsanalyse. miRNA som var negativt korrelert med F5 ekspresjon i en brystkreft kohort (OsloII) ble også inkludert i denne studien. In vitro analyse av miRNA: forbigående overekspresjon og inhibering av de respektive miRNAene ble oppnådd ved transfeksjon av miRNA etterligninger og inhibitorer. Direkte binding av F5 3’UTR ble bestemt vha luciferase reporter analyse i HEK293T celler. Effekten av overekspresjon av miRNA på endogene F5 og TFPI mRNA-nivåer ble bestemt med qRT-PCR og nivået av utskilt FV og TFPIalpha protein ble målt vha ELISA i HepG2 celler. Den funksjonelle effekten av overekspresjon av miRNAene på apoptose og levedyktighet ble bestemt med, henholdsvis, ELISA celledøddeteksjonssett og WST-1 analyse. miRNAenes kliniske signifikans ble evaluert ved å analysere deres ekskresjonsnivå sammenlignet med utfall hos leverkreft-pasienter ved bruk av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Ekspresjonsanalyse av miRNAene i tumor- versus friskt levervev ble utført i KM plotter. Resultater: Beregningsanalyse av F5 3’UTR identifiserte 12 miRNA- bindingssteder . Åtte av disse hadde i tillegg bindingssteder på TFPI 3’UTR. I tillegg ble det på begge geners 3’UTR identifisert bindingssteder for syv miRNA som var negativ korrelert med F5 i en brystkreftkohort (OsloII kohort). Totalt ble 19 miRNA valgt for videre validering i denne studien. Det ble funnet seks miRNA (miR-323a-3p, miR-568, miR-643, miR-651-3p, miR-1236-3p and miR-1278) som bandt til F5 3’UTR og nedregulerte F5 mRNAet og FV proteinnivået i HepG2 celler betydelig. I tillegg fant vi en miRNA (miR-7-5p) som nedregulerte TFPIalpha mRNA og TFPIalpha proteinnivået i HepG2 celler. Alle de syv validerte miRNAene hindret proliferasjon av HepG2 celler. Inhibering av miR-568 førte til en betydelig økning i proliferasjon. Overekspresjon av miR-7-5p, miR-323a-3p og miR-1236-3p fremmet apoptose i HepG2 celler. Høy miR-568, miR-643, miR-651-3p, miR-1236-3p og miR-1278 ekspresjon ble assosiert med økt estimert overlevelsestid hos pasienter med leverkreft, mens lav miR-7-5p og miR-323a-3p ekspresjon ble assosiert med det samme hos pasienter med leverkreft. Konklusjon: Denne studien demonstrerte av FV ekspresjon ved leverkreft blir direkte regulert av seks miRNAer. I tillegg ble det vist at TFPIalpha-ekspresjon ved leverkreft blir direkte regulert av miR-7-5p. Fremtidige studier er nødvendig for videre kartlegging av potensielle konsekvenser av disse miRNAenes feilregulering, både i forhold til HCC-cellenes prokoagulative rolle og progresjonen av leverkreft.