The chitinolytic system of Enterococcus faecalis V583 and its putative role in virulence

Abstract

From a harmless gut commensal, Enterococcus faecalis has undergone a transition towards a multi-resistant nosocomial pathogen, posing a major threat to human health, particularly in immunocompromised individuals. The aim of the present study was to shed light on putative virulence properties of the proteins associated with the chitinolytic machinery of E. faecalis V583. The proteins of interest are a GH18 chitinase (ef0361; EfChi18A), an AA10 lytic polysaccharide monooxygenase (ef0362; EfAA10A), a GH18 endo-β-N-acetylglucosaminidase (ef2863; EfEndo18A), and a combined GH18 endo-N-glycosidase and GH20 hexosaminidase (ef0114; EfEndoE). Although these proteins are presumed to be involved in chitin degradation, their enzymatic activities have also been linked to virulence in several other bacterial species.

The first part of the project was dedicated to investigating the potential roles of the putative chitinolytic enzymes in chitin hydrolysis. Gene-knockout strains were utilized for analysis of the separate proteins involved. Characterization of the wild type and gene deletion strains was based on analysis of morphology, growth rates on soluble and insoluble substrates, as well as enzymatic activity. Despite removal of complete sets of genes, the strains showed similar morphology and demonstrated similar growth rates on all the substrates tested. However, when cultivated on β-chitin the chitinase and LpmO did not give the bacteria a growth advantage and chitinase activity was not observed in the culture supernatants. N-acetylhexosaminidase activity was however detected when the bacteria were cultivated on β-chitin, suggesting possible involvement of EfEndoE and/or EfEndo18A in chitin metabolism, although this was not highly reflected in the growth experiments. The general observation was that E. faecalis V583 grew minimally on β-chitin, suggesting other roles of the proteins than chitin degradation.

In the second part of the project, the role of the putative chitinolytic enzymes in virulence was investigated using ex vivo human serum and human whole blood assays. Transcriptional analysis by ddPCR showed upregulation of the LpmO-gene in presence of serum, compared to low expression in bacteriologic medium. The virulence-properties of the LpmO was further examined through serum killing assays, which showed resistance of E. faecalis towards the complement-mediated killing of serum, regardless of the presence or absence of the LpmO. In human whole blood however, killing of the bacteria was indeed observed. Thus, deletion of LpmO did not result in promotion of bacterial viability.

In conclusion, the chitinolytic machinery of E. faecalis V583 was in this study found to show minimal activity towards chitin, in contrast to previously published studies. N-acetylhexosaminidase activity was demonstrated, but no chitinase activity was observed. Interestingly, LpmO-expression was highly induced in presence of serum, but deletion of LpmO did not result in attenuation of bacterial survival in whole human blood or serum. The induced expression of LpmO observed in presence of serum and whole blood could be related to a stress-induced response. Further work and optimizations of the assays presented in this study are likely to contribute to a greater understanding of the role of these proteins in E. faecalis pathogenesis.

Enterococcus faecalis har gått gjennom en forvandling fra en ufarlig tarm-kommensal til å bli et multiresistent, sykehusrelatert patogen, som utgjør en stor trussel mot menneskets helse, spesielt blant immunkompromitterte individer. Denne studien hadde som mål å avdekke putative virulens-egenskaper hos proteinene som er involvert i det kitinolytiske maskineriet hos E. faecalis V583. Proteinene av interesse er en GH18 kitinase (ef0361; EfChi18A), en AA10 lytisk polysakkarid monooksygenase (ef0362; EfAA10A), en GH18 endo-β-N-acetylglukosaminidase (ef2863; EfEndo18A), og en kombinert GH18 endo-N-glykosidase og GH20 heksosaminidase (ef0114; EfEndoE). Selv om disse proteinene antas å være involvert i kitinnedbrytning, så har slike enzymaktiviteter blitt koblet til virulens for flere andre bakteriearter.

Prosjektets første del var dedikert til undersøkelse av potensielle roller for de antatte kitinolytiske enzymene innen kitinhydrolyse. Gen-delesjon-stammer ble brukt for analyse av de spesifikke proteinene involvert. Villtypen og delesjonsstammene ble karakterisert basert på morfologi, veksthastighet på løselige og uløselige substrater, samt enzymatisk aktivitet. Til tross for at komplette gener ble fjernet, viste stammene lik morfologi og relativt like vekstrater på alle de testede substratene. Kitinase- og LpmO-proteinene gav imidlertid ikke bakteriene noen vekstfordel i β-kitin og kitinaseaktivitet ble ikke observert i kultur-supernatantene. N-acetylheksosaminidase-aktivitet ble imidlertid detektert da bakteriene ble dyrket på β-kitin, hvilket kan indikere at EfEndoE og/eller EfEndo18A er involvert i kitinmetabolisme, til tross for at vekstkurvene ikke reflekterte dette funnet. Generelt sett vokser E. faecalis minimalt på β-kitin, hvilket kan tyde på at disse proteinene har andre roller enn kitinnedbrytning.

I prosjektets andre del ble proteinenes antatte rolle innenfor virulens analysert gjennom ex vivo humanserum- og humanfullblods-assays. Transkripsjonsanalyse ved hjelp av ddPCR viste oppregulering av LpmO-genet i nærvær av serum, sammenlignet med lavt uttrykk i bakteriologisk medium. Virulensegenskapene til LpmO-proteinet ble videre undersøkt gjennom serum-assays, der E. faecalis viste resistens mot komplement-mediert lysis i serum, uavhengig av proteinets tilstedeværelse. I human-fullblod derimot, ble det observert kraftig reduksjon i bakterieantall. Delesjon av LpmO resulterte derfor ikke i økt bakteriell overlevelse.

Arbeidet i denne studien avdekket minimal aktivitet av det kitinolytiske maskineriet til E. faecalis V583 i kitin, til tross for at tidligere studier har vist funksjonell aktivitet. N-acetylheksosaminidaseaktivitet ble demonstrert, men det ble ikke observert kitinaseaktivitet. LpmO-ekspresjon ble sterkt indusert i serum, men delesjon av proteinet resulterte ikke i redusert bakteriell overlevelse i fullblod eller serum. Den induserte ekspresjonen av LpmO i nærvær av serum og fullblod kan ses i sammenheng med en stress-indusert respons. Videre arbeid og optimaliseringer av assayene presentert i denne studien vil trolig bidra til bedre forståelse av disse proteinenes rolle i E. faecalis patogenese.