Co-immunoprecipitation with the multi-peptide bacteriocin GarKS immunity protein

Abstract

Garvicin KS (GarKS) is a bacteriocin recently discovered in Lactococcus garvieae belonging to a novel group of multi-peptide bacteriocins, whose receptor and mode of action is unknown. In this thesis heterologous expression of the immunity gene in Lactococcus lactis and Staphylococcus aureus was shown to provide immunity to GarKS in both species. In addition, the garvicin KS immunity protein (GakI) was shown to confer immunity also to aureocin A70 in L. lactis. Variants of GakI fused with a FLAG-tag did not change the normal function of this immunity protein.

The thesis further describes the successful optimization for co-immunoprecipitation (Co-IP) of GakI. A washing buffer using the combination of the detergent IGEPAL CA-630 at 1% and 0.575 M NaCl was developed. Using this buffer the immunity protein was shown to co-precipitate with three proteins at approximately 25, 27 and 52 kDa. Immunoprecipitate was analyzed by mass spectrometry but the three aforementioned proteins remains to be identified.

Genomic analysis of GarKS mutants was performed and revealed mutations in ythA and cesR, both likely involved in a general stress response against agents that perturb the cytoplasmic membrane. Further, proteomic analysis identified a high abundance of proteins involved in this response; YthC, YneH and FtsH in cells producing GakI and exposed to GarKS. Together they provide valuable insights into two little-understood general stress response systems in lactococci.

Garvicin KS (GarKS) er et bakteriosin nylig oppdaget i Lactococcus garvieae som tilhører en særegen gruppe av fler-peptid bakteriosiner med en reseptor og virkemåte som er ukjent. Heterologt uttrykt immunitetsgen i Lactococcus lactis og Staphylococcus aureus ble vist å gi immunitet i begge arter med en økning i minimum inhiberingskonsentrasjon på henholdsvis 130 og 14-ganger . Garvicin KS immunitetsproteinet (GakI) ga også immunitet mot aureocin A70 i L. lactis med en 97-gangers økning eller mer. GakI med fusjonert FLAG-tag hadde liknende aktivitet. I denne oppgaven fremstilles en optimaliert protokoll for ko-immunoutfelling av GakI. En vanskeprotokoll basert på en kombinasjon av det overflateaktive stoffet IGEPAL CA-630 på 1% og 0.575 M NaCl ble utviklet. Ved bruk av denne kombinasjonen ble tre proteiner ko-immunoutfelt med GakI med estimerte masser på 25, 27 og 52 kDa. Analyse ved hjelp av massespektrometri ble utført på immunoutfellingsprøvene, men proteinene lot seg ikke identifisere. Helgenomanalyse av mutanter for GarKS ble utført og viste mutasjoner i ythA og cesR, som begge høyst sannsynlig er en del av et generelt stress respons system mot stoffer som forstyrrer cellemembranen. Videre proteomanalyse av kulturer som produserer GakI utsatt for GarKS viste en høy mengde YthC, YneH og FtsH, som alle er en del av denne responsen. Sammen gir dataene en innsikt i to stress respons systemer i laktokokker som er lite forstått.