YthA : a lone ranger or team player in the cell envelope stress response of Lactococcus lactis IL1403?

Abstract

Considering the increasing problem of antibiotic-resistant pathogens emerging world- wide, research into novel antimicrobial substances that can become clinically relevant is now of the utmost importance. The small antimicrobial peptides known as bacteriocins, may represent a valid option. Lactic acid bacteria produce several well- known bacteriocins, including the newly discovered garvicin KS, whose mechanism of action is still not understood. Previous work has identified strains of Lactococcus lactis IL1403 that show increased resistance to garvicinKS, attributed to a mutation in the pspC-homologue ythA. Efforts to unravel the role of YthA in the garvicin KS mechanism of action, has led to the development a working model hypothesizing that YthA is involved in activation of the cell envelope stress regulatory system CesSR. In this thesis, previously isolated resistant mutants were characterized with respect to antimicrobial resistance and by microscopy approaches. To further understand this mechanism, quantitative PCR was used to relatively quantify expression levels of key genes in ythA mutants. Based on our results, we cannot conclude to what extent mutations in ythA affects the expression levels of CesSR. However, we show that stress in the form of sublethal doses of garvicin KS induces the expression of the yth- operon as well as genes associated with CesSR in wild type L. lactis IL1403. A positive correlation between dose and upregulation was also observed. This strongly suggests involvement of the yth-operon in the stress response mechanism of L. lactis. In further work, it will be necessary to confirm interactions between YthA and constituents of CesSR to better understand this stress response and how YthA is involved. The research presented here expand our knowledge of bacteriocins and their mechanisms, which is necessary for the development of novel, clinically relevant bacteriocins.

Det stadig økende problemet med antibiotikaresistente patogener på verdensbasis nødvendiggjør forskning på nye antimikrobielle stoffer med potensiale for klinisk bruk. Et lovende alternativ er de små antimikrobielle peptidene produsert av bakterier, kjent som bakteriociner. Melkseyrebakterier produserer flere kjente bakteriociner, inkludert det nyoppdagede garvicin KS, som ikke enda har en kartlagt virkemekanisme. Tidligere arbeid har identifisert stammer av Lactococcus lactis IL1403 med økt resistens mot dette bakteriocinet, som en følge av mutasjon i pspC-homologen ythA. Arbeidet med å forstå hvilken rolle YthA har i resistensmekanismen mot garvicin KS, har resultert i en hypotese om at YthA aktiverer cell envelope stress response system, CesSR. Resistente mutant-stammer ble karakterisert med hensyn på resistens mot ulike antimikrobielle forbindelser og ved mikroskopi. For å forstå denne mekanismen ytterligere ble kvantitativ PCR brukt til å relativt kvantifisere ekspresjonsnivåer av gener forbundet med CesSR i ythA-mutanter. Basert på resultatene kan vi ikke med sikkerhet si at mutasjoner i ythA påvirker uttrykksnivåene av CesSR. Derimot fant vi at stress, i form av subletale doser av garvicin KS, induserer ekspresjonen av yth-operonet, samt gener som er assosiert med CesSR i villtype L. lactis IL1403. Det ble også observert en positiv korrelasjon mellom dose og oppregulering. Dette antyder en sammenheng mellom yth-operonet og CesSR i L. lactis IL1403 under stress. Det vil videre være nødvendig å bekrefte interaksjoner mellom YthA og bestanddelene i CesSR på proteinnivå for å få en bedre forståelse av denne stressresponsmeksnismen og av hvordan YthA er involvert. Denne type forskning er nødvendig for å forbedre våre kunnskaper om bakteriociner og deres mekanismer, som er nødvendig for utviklingen av klinisk relevante bakteriociner.