Implementation of a two-plasmid CRISPR/Cas9 system in Lactobacillus plantarum : a new approach in the development of a novel vaccine against Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Tuberculosis (TB) is the leading cause of deaths from a single infectious agent, and in 2017 1.7 million people died from TB. To date the only available vaccine against the disease is the bacille Calmette-Guèrin (BCG) vaccine. The BCG vaccine does not ensure full protection against the mature form of TB, and is not recommended to immunocompromised patients. Therefore, a new and more effective vaccine is urgently needed. This study is a part of a larger project with a long-term goal to develop mucosal vaccines, utilizing the lactic acid bacteria (LAB) Lactobacillus plantarum as delivery vectors of antigens. LAB occurs in a wide range of habitats, ranging from food products such as fruit and dairy, but also human mucosal surfaces such as the small intestine and colon. Lactobacilli are natural inhabitants of the human gastro intestinal tract (GIT) and are generally regarded as safe (GRAS). Some Lactobacilli are believed to have probiotic properties and live in close association with the intestinal epithelium and have shown immunomodulatory effects in human. These properties make Lactobacilli, such as L. plantarum, an ideal candidate as a delivery vector of immunogens.

In the present study, pSIP inducible vectors for cytoplasmic and membrane anchoring of the TB fusion antigen Ag85B_TB10.4 in L. plantarum were constructed, and production of surface localized antigen was confirmed. Currently, the production of the antigen is plasmid based. To reduce the number of heterologous genes of the recombinant L. plantarum, it is desirable to integrate the antigen production into genome of the bacteria. In this thesis, methods for utilization of the CRISPR/Cas system was attempted developed for integration of the antigen. To simplify integration, as it is independent of helper genes unlike the pSIP system, construction of vectors for constitutive production of Ag85B_TB10.4 were attempted. Evaluation of the functionality of the CRISPR/Cas system in L. plantarum was performed through experiments of gene editing, replacement and depletion with Cas9, Cas9D10A and dCas9.

In conclusion, Ag85B_TB10.4 was successfully anchored to the cell membrane of L. plantarum by using the pSIP system, while construction of a vector for constitutive production of Ag85B_TB10.4 failed. Conceivably due to toxicity of the constitutive production of the antigen in E. coli. The CRISPR/dCas9 system was successfully developed, and reduction of transcripts of target genes was confirmed by ddPCR. Gene editing and exchange with Cas9 and Cas9D10A gave the expected phenotype, but no mutations were detected from DNA sequencing. These methods require further optimisations.

Tuberkulose (TB) er hovedårsaken til dødsfall forårsaket av en infeksjonssykdom. I 2017 døde 1.7 millioner mennesker av TB. Per dags dato er bacille Calmette-Guèrin (BCG) vaksinen den eneste tilgjengelige vaksinen som beskytter mot sykdommen. En stor svakhet ved BCG-vaksinen er at den ikke sørger for full beskyttelse mot den modne og smittsomme formen av TB, og anbefales ikke til immunkompromitterte pasienter. På grunn av dette er utvikling av en ny vaksine mot TB høyst nødvendig. Denne studien er en del av et større prosjekt, hvor langtidsmålet er å utvikle slimhinne vaksiner, ved å utnytte melkesyrebakterien Lactobacillus plantarum som leverings vektor av antigener. Melkesyrebakteriene finnes i mange varierte habitater, fra matprodukter som frukt og melkeprodukter, men også som en del av den naturlige tarmfloraen hos mennesker. På bakgrunn av dette regnes melkesyrebakteriene generelt som trygge. Noen Laktobasiller er også kjent for å ha probiotiske egenskaper, nær tilknytning til tarmepitelet, samt immunmodulerende effekter. Disse egenskapene bidrar til at Laktobasiller, som L. plantarum, anses som ideelle kandidater som leverings vektorer av immunogener.

I denne studien ble pSIP induserbare vektorer for intracellulær og membranankret produksjon av TB hybridantigenet Ag85B_TB10.4 i L. plantarum konstruert, og produksjon av overflate lokalisert antigen ble bekreftet. Foreløpig har produksjonen av antigener vært plasmidbasert. For å redusere antall heterologe gener i rekombinante L. plantarum, er det fordelaktig å integrere antigen produksjonen inn i genomet til bakterien. I denne oppgaven ble ulike metoder for bruk av CRISPR/Cas systemet forsøkt utviklet, for integrering av antigenet. For å forenkle integreringen ble det forsøkt konstruert vektorer for konstitutiv produksjon av Ag85B_TB10.4. I motsetning til pSIP systemet, avhenger ikke det konstitutive ekspresjonssystemet av andre gener for aktivering. Funksjonaliteten til CRISPR/Cas systemet i L. plantarum ble evaluert ved utførelse av eksperimenter for gen-editering, -utbytte og -nedregulering mediert av Cas9, Cas9D10A og dCas9.

Arbeidet som er beskrevet i denne masteroppgaven viser at en vektor for overflateankret Ag85B_TB10.4 produsert av pSIP systemet ble konstruert, mens konstruksjon av en vektor for konstitutiv produksjon av Ag85B_TB10.4 mislyktes. En mulig årsak til den mislykkede konstruksjon kan være at konstitutiv produksjon av antigenet er toksisk for Escherichia coli. CRISPR/dCas9 systemet, for nedregulering av genuttrykk, ble utviklet og nedreguleringen av målgenene ble bekreftet med ddPCR. Gen-editering og -utbytte av gener med Cas9 og Cas9D10A produserte den forventede fenotypen, men sekvensering avslørte villtype sekvens. Disse metodene behøver derfor videre optimering.