The host DNA challenge in the analysis of microbiota from Atlantic salmon (Salmo salar)

Abstract

DNA contamination is a challenge in the modern age of new generation sequencing. Contaminants lead to misassembly, wrongful associations and a decrease in cost efficiency of sequencing. The same is true for host DNA contamination. Outnumbering the total DNA of target microorganisms in samples from blood or faeces, eukaryotic host DNA not only increase the general costs of sequencing many samples but also reduce general sequencing yield and depth. Most protocols and techniques in place today for dealing with contaminations is based on the level of methylation present in humans but lack the broad spectrum required for general use regardless of the target host organism. The use of propidium monoazide (PMA) has been proposed as a solution. Coupled with an appropriate lysis protocol, the PMA method may even be used for selective microbial assays, as well as for removal of DNA contaminations. Atlantic Salmon (Salmo salar) was used as a model organism representing the eukaryotic host. The effect of PMA was evaluated using in vitro samples of live and dead E.coli DH5α and pure salmon DNA from salmon sperm in conjunction with qPCR, and the effect of PMA treated samples were compared against control samples. In addition, a detergent varying in concentration was used to selectively lyse eukaryotic cells without harming E.coli or E.faecalis as representatives of gram-negative and gram-positive bacteria. Lastly, pilots were treated using a finalized PMA method on real salmon intestine samples inoculated with E.coli. The use of PMA for removal of contaminating DNA in vitro samples was deemed promising, as living cells treated with the method showed no inactivation while specifically killed bacteria and free eukaryotic DNA was inactivated. However, results were difficult to replicate due to difficulties regarding the viability of the E.coli cultures. Using the Triton x-100 detergent on bacteria, E.coli showed a higher tolerance in comparison to the E.faecalis. Furthermore, procured salmon samples showed a low abundance of eukaryotic DNA present, as well as inconclusive PMA results due to varying inactivation between live samples of E.coli in the same assays and between assays. Sequencing of bacterial diversity observed the same species of which have been earlier described as the most dominant in Atlantic Salmon, while a selective inactivation of E.coli by PMA and not the microorganisms naturally present was observed. Use of the PMA method for general inactivation of a wide array of samples is deemed promising, albeit further evaluations of a selective lysis protocol targeting eukaryotic cells, as well as an evaluation of the PMA effect on real-life samples is required.

DNA kontaminasjon er en utfordring for dagens sekvensering. Kontaminanter kan føre til feil ved DNA-sammensettinger, feilaktig assosiasjoner og mindre kostnadseffektiv sekvensering. Kontaminasjon av DNA fra verter viser også de samme problemene. Eukaryot DNA er i overtall i forhold til mikroorganismer fra blod- og faeces-prøver, og fører dermed til høyere kostnader for sekvensering og lavere sekvenseringsmengde og dybde. Det finnes protokoller i dag som har som hensikt å løse problemene med verts-DNA, men de fleste er basert på metyleringsnivå for mennesker, og kan dermed ikke brukes uavhengig av verts-organisme. Bruk av propidium monoazid (PMA) er blitt sett på som en mulig løsning. Sammen med en passende lysis protokoll kan PMA ikke bare brukes for selektive undersøkelser for mikroorganismer, men også for generell fjerning av DNA. Atlanterhavslaks (Salmo salar) ble brukt som modellorganisme for å representere en eukaryot vert. Effekten av PMA ble så undersøkt ved bruk av enkle prøver med levende og døde E.coli DH5α og rent DNA fra laksesperm. Disse prøvene ble undersøkt med qPCR og sammenlignet med ubehandlede kontrollprøver. Triton-detergent ble også testet med varierende konsentrasjoner på E.coli og E.faecalis som representanter for henholdsvis gram-negative og gram-positive bakterier for å finne en optimal konsentrasjon som selektivt lyserer eukaryote celler. Til slutt ble PMAbehandling testet på pilotprøver med tarmskvis fra atlanterhavslaks inokulert med E.coli, prøver som senere ble sekvensert. PMA for fjerning av kontaminerende DNA viste gode indikasjoner, da levende celler behandlet med metoden ikke viste tegn til inaktivering i motsetning til døde bakterier og rent DNA fra laks. Resultatene var derimot vanskelige å replikere grunnet problemer med E.colikulturer som viste seg å ikke være levedyktige. Forsøk med Triton-detergent på bakterier viste en høyere toleranse for E.coli i forhold til E.faecalis. Videre viste forsøk med prøver fra laksetarm lave nivåer av 18S DNA samtidig som at PMA-behandling på disse prøvene viste upålitelige resultater på grunn av mangelfull levedyktighet for E.coli. Videre sekvensering av prøver fra laksetarm viste samsvar mellom bakterier som tidligere er funnet i laksetarm og de aktuelle bakteriene som ble observert. I tillegg ble det gjennom sekvenseringen observert en selektiv inaktivering av E.coli etter behandling med PMA. Siden de tidlige simulerte og enkle prøvene viste selektiv inaktivering av forventet fritt DNA og sekvensering av prøvene bekreftet dette, ser bruken av PMA-metoden for generell inaktivering av kontaminerende DNA lovende ut. Videre evalueringer er derimot nødvendig for å utvikle en brukbar protokoll for selektiv lysis, samtidig at det er nødvendig å stadfeste effekten av PMA på ekte prøver.