The effects of eggshell membrane on muscle formation in 2D and 3D environments

Abstract

A shortage of available tissues and organs for transplantation has led to suffering and death for many people. Tissue engineering could be a possible solution to this shortage, and the most common approach is to use a biomaterial to create a three dimensional scaffold that can mimic the role of extra cellular matrix during in vivo tissue formation. A potential material to apply in tissue engineering could be the eggshell membrane (ESM), which share several similarities with the extra cellular matrix, and has been linked to improved wound healing. These properties make the eggshell membrane a promising material for tissue engineering using a 3D scaffold. The main purpose of this study was to observe the effects of ESM on muscle cells isolated from the sirloin of a newly slaughtered bovine in 2D and 3D environments. ESM was administrated to primary muscle cells in either powdered or hydrolyzed form in 2D environments. Powdered ESM was added directly or as a component of the cell-coating. The Effect of ESM on proliferation, viability and cytotoxicity was measured using different types of assays. Real time-PCR was used with several differentiation markers to study the effect of ESM on cell-differentiation. During the 3D experiments, cells were allowed to interact with either a pure collagen or ESM scaffold. Immuno-staining with fluorescent antibodies was then used to study cell-scaffold interaction. Differentiation was measured for cells interacting with the scaffolds using RT-PCR with several markers for differentiation markers and connective tissue. During the 2D experiments we observed that cells preferred to interact with the ESM material when presented as a component of the cell-coating. Further observations showed that ESM had a positive effect on the migration rates for cells, and that cells interacting with the material would seem to enter differentiation earlier. The use of immuno-staining showed that cells were able to migrate into the scaffold. It was concluded that cell performance was dictated by how ESM was presented. Cells seems to be positively affected by ESM in 2D and 3D environments, which promotes further study into the possible applications for the material in tissue engineering.

Som en følge av mangel på organer og vev tilgjengelig for transplantasjon har flere personer endt opp med å få sin livskvalitet betraktelig redusert, eller dødd. En mulig løsning på dette problemet er å produsere kunstig vev og organer som kan fylle mangelen. Den mest vanlige måten å danne kunstig vev på er å bruke et biomateriale til å lage en 3D støttestruktur som kan etterligne rollen til den ekstracellulære matriks, som er viktig under vanlig dannelse av vev. Et material som har vist stort potensial er eggeskall membranen (ESM), som deler flere likheter med den ekstracellulære matriksen, og har blitt koblet til forbedringer under sårheling. Dette er egenskapene gjør eggeskall membranen til et lovende biomateriale for å danne en 3D støttestrukturen til produksjonen av vev. Målet til denne oppgaven har vært å undersøke hvordan ESM påvirket muskelceller isolert fra ytrefilene til nyslaktet storfe i 2D og 3D miljøer. ESM ble tilført primære muskel celler som pulver eller hydrolysat i 2D miljøer. Pulveret ble tilsatt direkte eller som en komponent i celle-coatingen. Effekten av ESM på proliferasjon, viabilitet og cytotoxitet ble målt med ulike assays, og celledifferensiering ble målt via Real Time-PCR med ulike differensieringsmarkører for mRNA. I 3D forsøk ble muskel celler tillatt å vokse på scaffolds som besto med og uten ESM. Immuno-blotting med fluoriserende antistoffer ble brukt til å studere hvordan cellene interagerte med scaffoldene. Celledifferensiering i scaffoldene ble målt med RT-PCR med ulike differensiering og bindevevs markører. Resultatene for 2D forsøkene viste at cellene foretrakk å interagere med lave konsentrasjoner av ESM pulver når det ble presenter som en komponent av celle-coatingen. Resultatene viste en nedgang i cytotoxitet, forbedret migrasjons hastighet og tidligere differensiering samt at viabilitet og proliferasjon virket upåvirket. I 3D forsøkene ble det observert at cellene var i stand til å forflytte seg inn i ESM scaffoldene. Det konkluderes med at måten ESM ble presentert på avgjorde effekten av materialet på muskelcellen. Cellen ser ut til å bli positivt påvirket av ESM i 2D og 3D miljøer, noe som legger til grunne for fremtidige studier for mulige bruksområder til materialet i vev skapelse.