Characterization of quinolone resistant Escherichia coli from broilers with focus on plasmidmediated quinolone resistance

Abstract

Widespread use of antimicrobial agents has generated antimicrobial resistance (AMR) among bacteria. The occurrence of AMR in Norwegian broiler production is low in a European and a global perspective and this is probably because of the restricted usage of antimicrobial agents. The World Health Organization has defined fluoroquinolones as critically important for treatment of infections in humans. Plasmid-Mediated Quinolone Resistance (PMQR) comprises a large group of genes conferring low-level resistance to fluoroquinolones and these are qnr-genes, aac(6’)-lb-cr gene, qepA, and oqxAB genes. Presence of both PMQR and chromosomally mediated resistance mechanisms to quinolones has shown to give a higher level of resistance in isolates of Enterobacteriaceae. In the absence of chromosomally mediated quinolone resistance mechanisms, the acquisition of only a PMQR gene will not display clinical resistance. The aim of this study was to characterize five E. coli strains isolated from poultry encoding PMQR genes and to characterize and circularize one plasmid from one of the strains and compare it to other plasmids. Characterization of strains were carried out by phenotypic methods such as susceptibility testing, conjugation, and transfer frequency, molecular genotyping and identification of resistance mechanisms based on Whole Genome Sequencing (WGS) data. The plasmid characterization was based on WGS data, circularization was done by using PCR and Sanger sequencing. Annotations were carried out by RAST and comparison by BLAST and BRIG. The five E. coli harboured the PMQR genes qnrS1 or qnrB19 encoding quinolone resistance. In addition, they harboured a blaTEM-1B–gene encoding a β-lactamase. Four of the five strains carrying a qnrS1 gene contained a self-transferable IncX1 plasmid. The E. coli strain carrying a qnrB19 were not able to conjugate under the conditions used in this experiment. All five E. coli strains displayed MIC to ciprofloxacin above the ECOFF. The four strains carrying qnrS1 displayed MIC to ciprofloxacin above the clinical breakpoint, thus were clinically resistant to ciprofloxacin. Plasmid pNVI7234 was 47 686 bp in size and was isolated from an E. coli O23:H16 and ST-453. pNVI7234 shared close homology with plasmids isolated from two Shigella flexneri strains. Annotation of the plasmid revealed a plasmid backbone encoding genes involved in conjugal transfer and partitioning systems, and a toxin-antitoxin system ensuring persistence in bacterial hosts.

Utstrakt bruk av antimikrobielle midler har forårsaket antimikrobielle resistens i bakterier. I norsk fjørfeproduksjon er forekomsten av antimikrobiell resistens lav både i et europeisk og globalt perspektiv og den lave forekomsten skyldes sannsynligvis begrenset bruk av antimikrobielle midler. Verdens Helseorganisasjon har definert fluorokinoloner som kritisk viktige for behandling av humane infeksjoner. Plasmidmediert kinolonresistens omfatter en stor gruppe gener som gir resistens mot fluorokinoloner ved lave konsentrasjoner og disse genene er qnr-gener, aac(6’)-lb-cr, qepA og oqxAB gener. Forekomst av plasmidmediert og kromosomal kinolonresistens har i kliniske Enterobacteriaceae isolater gitt høygradig resistens mot kinoloner. Forekomst av kun et enkelt plasmidmediert kinolonresistensgen gir ikke klinisk resistens. Formålet med studien var å karakterisere og sammenlikne fem E. colistammer isolert fra fjørfe som inneholdt plasmidmedierte kinolonresistensgener. Fra en av stammene skulle et plasmid karakteriseres og lukkes for videre sammenlikning med liknende plasmider. Karakterisering og sammenlikning av stammer ble utført ved fenotypiske metoder som testing av følsomhet mot antimikrobielle midler, konjugeringsforsøk og overføringsfrekvens ved konjugering, og molekylær genotyping og identifisering av resistensmekanismer ved bruk av data fra helgenomsekvensering. Plasmidkarakteriseringen ble utført ved helgenomsekvensbaserte metoder og lukking av plasmid ble utført ved PCR og Sanger sekvensering. Annotering av plasmidet ble utført ved bruk av RAST, og sammenlikning med andre plasmid ble utført ved bruk av BLAST og BRIG. De fem E. coli inneholdt de plasmidmedierte kinolonresistensgenene qnrS1 eller qnrB19. Alle E. coli isolatene inneholdt i tillegg et blaTEM-1B-gen som kodet for en β-laktamase. Fire av stammene inneholdt et qnrS1-gen på et overførbart IncX1 plasmid. Stammen som inneholdt et qnrB19 gen lot seg ikke overføre under de eksperimentelle betingelsene. Alle fem E. coli uttrykte MIC mot ciprofloxacin høyere enn det epidemiologiske brytningspunktet (ECOFF) og fire av fem stammer var klinisk resistente mot ciprofloxacin. Det sirkulariserte plasmidet pNVI7234 var i størrelsesorden 47 686 basepar og ble isolert fra en E. coli O23:H16 og ST-453. pNVI7234 var nært beslektet med plasmider fra to Shigella flexneri stammer. Annotering av plasmidet avslørte en konservert del bestående av gener som koder for overføring, oppdeling (partitioning systems), og et toksin-antitoksin system som sikrer plasmidets persistens i vertsbakterien.