Uttrykk og karakterisering av en superoksid dismutase og en dihyrolipoamid dehydrogenase fra Thermobifida fusca

Abstract

Denne oppgaven er skrevet som en del av et større forskningsprosjekt med et overordnende mål om å tilegne seg kunnskap om ligninnedbrytende enzymer til jordbakterien Thermobifidia fusca. Lignocellulose består hovedsakelig av karbohydratpolymerer (cellulose og hemicellulose) og en aromatisk polymer (lignin). Etter cellulose er lignin den vanligste biopolymeren i naturen og består av monolignoler som er krysskoblet med eterbindinger eller karbon-karbon bindinger. Cellulose består av sekskarbonsukker, mens hemicellulose er bygd opp av fem – og sekskarbonsukker. I naturen blir lignocellulose brutt ned via enzymkatalysert radikalkjemi. Den gramnegative bakterien T.fusca skiller ut flere oppregulerte enzymer som er ligninaktive når den gror på lignocellulose. Dihydrolipoamide dehydrogenase og superoksid dismutase er blant de oppregulerte enzymene. I denne oppgaven har de to enzymene dihydrolipoamide dehydrogenase og superoksid dismutase fra T.fusca blitt karakterisert. Dihydrolipoamide dehydrogenase viste høyest aktivitet ved pH 6.0 og t = 40 °C. Den har to smeltetemperaturer henholdsvis t = 51 °C og t = 88 °C ved pH 7.5. Superoksid dismutasen viste høyest aktivitet ved pH 7.5 og var stabilt aktiv fra t = 30 °C til 80 °C. Den har en smeltetemperatur lik 78.9 °C ved pH 8.0. TfSODs krystallstruktur avslørte jern som kofaktor i det aktive setet, bundet til tre histidiner, en aspartat og to vannmolekyler. Cellepotensialet til TfSOD på 287 mV stemmer overens med redokspoteintalet til SODer generelt (~ 300 mV). En antatt lakkase og hjelpeenzymet E8 fra T.fusca ble forsøkt å uttrykkes for videre bruk i en enzymløsning bestående av ulike enzymer med synergisk effekt ved enzymatisk nedbrytning av lignocellulose. Enzymuttrykket ble ikke vellykket.

This thesis is a minor part of a research project with the main goal to acquiring knowledge of the ligninolytic model system for the soil bacterium Thermobifida fusca for the decomposition of lignocellulose. Lignocellulose consist mainly of carbohydrate polymers (cellulose and hemicellulose) and an aromatic polymer (lignin). After cellulose, lignin is the most abundant biopolymer in nature and it consist of monolignols that is cross-linked with ether bonds or carbon-carbon bonds. Cellulose consists of six carbon sugars, meanwhile hemicellulose has sixand five carbon sugars. In nature lignocellulosic biomass is degraded by enzyme catalyzed radical chemistry. The gram-negative bacterium T.fusca secrets several upregulated enzymes that are active on lignin when growing on lignocellulose. Dihydrolipoamide dehydrogenase and superoxide dismutase are among the upregulated enzymes. In this thesis, the two enzymes dihydrolipoamde dehydrogenase and superoxide dismutase from T.fusca have been characterized. Dihydrolipoamide dehydrogenase showed highest activity at pH 6.0 and t = 40 °C. It has two melting points at t = 51 °C and t = 88 °C at pH 7.5 respectively. Superoxide dismutase showed highest activity at pH 7.5 and had stable activity from t = 30 °C to 80 °C with a melting temperature equal to 78.9 °C at pH 8.0. The crystal structure of TfSOD revealed iron as the cofactor in the active site, bound to three histidine residues, an aspartate and two water molecules. The cell potential of TfSOD of 287 mV corresponds to the redox value of SOD in general (~ 300 mV). An assumed laccase and the auxiliary enzyme E8 from T.fusca were attempted to be expressed for further us in an enzyme cocktail containing different enzymes with synergic effect towards the degradation of lignocellulose. The attempt failed.