Detektering av betalaktamaser med utvidet spektrum (ESBL og karbapenemaser) i bakterier isolert fra akvatiske miljøer ved bruk av fenotypiske og genotypiske metoder

Abstract

Background: Antibiotic resistance is an escalating threat to the global health. Since the introduction of penicillin approximately 70 years ago, the development of resistance has increased along with the use of antibiotics. Proper use of these drugs is therefore crucial. It is particularly important to focus on the beta-lactams, the most commonly used antibiotic group in the world, that Gram-negative bacteria from the Enterobacteriaceae family have developed extended spectrum beta-lactamases (ESBL) towards. Purpose: The main goal of this thesis was to investigate the presence of Gram- negative bacteria with clinically significant genes encoding ESBL and carbapenemases in water samples from NMBU campus. An investigation of such bacteria and genes can give a further insight into their origin. Differences and similarities between detected genes in the water samples and genes that have been isolated from animals and humans in Norway were studied, as well as their dissemination mechanisms. Methods: Three water samples were collected from NMBU campus during the spring 2018 and filtered. The filters were transferred to selective medias for detection of ESBL and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (BrillianceTM ESBL and BrillianceTM CRE Agar). BrillianceTM MRSA2 Agar was also used to look for MRSA. Genotypic methods included amplification and separation of DNA with PCR (multiplex and singleplex) and gel electrophoresis, as well as Sanger sequencing (16S rRNA and resistant genes) and whole genome sequencing (MinION). Molecular methods were used to confirm or debunk phenotypical findings, as well as to examine which genes and bacteria that were in the samples. Results: Cultivated water samples on selective agars grew on five and six media that respectively selected for ESBL and carbapenemresistant Enterobacteriaceae. By using PCR, gel electrophoresis and Sanger sequencing, blaCMY from ESBL M-C, as well as blaTEM and blaCTX-M-15 from ESBL A were detected. Genotypic analyses also detected the bacteria Escherichia coli, which may occur in water by fecal contamination. Conclusion: There are ESBL-producing Gram-negative bacteria in the Niagara stream from proven findings in this thesis. The results are unsettling since Norway is considered to have a low prevalence of resistance genes. This study has indicated the importance of further research on ESBL and carbapenemases in the Norwegian environment to prevent further spread of resistant genes.

Bakgrunn: Antibiotikaresistens er en eskalerende trussel mot den globale helsen. Siden introduksjonen av penicillin for ca 70 år siden, har resistensutviklingen steget parallelt med bruken av antibiotika. En forsvarlig bruk av legemiddelet er derfor avgjørende. Det er særdeles viktig å rette fokus mot betalaktamer, den hyppigst brukte antibiotikagruppen i verden, som flere Gram-negative bakterier fra familien Enterobacteriaceae har utviklet ekstenderte spektrum betalaktamaser (ESBL) mot. Hensikt: Hovedformålet med denne oppgaven var å undersøke forekomsten av Gram-negative bakterier med klinisk signifikante gener som koder for ESBL og karbapenemaser i vannprøver fra NMBU campus. En granskning av slike bakterier og gener kan gi en ytterligere innsikt i deres opphav. Det ble studert ulikheter og likheter mellom detekterte gener i vannprøvene og gener isolert fra ville dyr, produksjonsdyr og mennesker i Norge, samt deres spredningsmekanismer. Metode: Tre vannprøver ble hentet inn fra Andedammen og Niagarabekken vårsemesteret 2018 og filtrert. Filtrene ble overført til selektive skåler for detektering av ESBL og karbapenemresistente Enterobacteriaceae (BrillianceTM ESBL og BrillianceTM CRE Agar). BrillianceTM MRSA2 Agar ble også brukt for å finne MRSA. Genotypiske metoder inkluderte amplifisering og separering av DNA med henholdsvis PCR (multipleks og singelpleks) og agarosegelelektroforese, samt Sanger- sekvensering (16S rRNA og resistengener) og helgenomsekvensering (MinION). Molekylære metoder ble benyttet for å bekrefte eller avkrefte fenotypiske funn, samt undersøke hvilke gener og bakterier som var i prøvene. Resultater: Rendyrkede kolonier på selektive medier viste vekst på fem og seks skåler som henholdsvis selekterte for ESBL og karbapenem-resistente Enterobacteriaceae. Ved bruk av de molekylære metodene PCR, gelelektroforese og Sanger-sekvensering ble blaCMY fra ESBL M-C, samt blaTEM og blaCTX-M-15 fra ESBL A påvist. Genotypiske analyser viste også positive funn av bakteriene Escherichia coli, som kan forekomme i vann ved fekal forurensning. Konklusjon: Det eksisterer ESBL-produserende Gram-negative bakterier i Niagarabekken ut ifra positive funn. Resultatene er foruroligende tatt i betraktning av at Norge anses for å ha en lav prevalens av resistensgener. Denne studien indikerer viktigheten av videre forskning på ESBL og karbapenemaser i miljøet i Norge, for å unngå en ytterligere spredning av resistente gener.