Bakteriofager mot Lactococcus lactis og effekten av eksopolysakkarider på bakteriofagfølsomhet

Abstract

Eksopolysakkarider produseres av mange bakterier, blant annet av Lactococcus lactis. Det har tidligere blitt diskutert om eksopolysakkarider kan beskytte bakterier mot bakteriofagangrep. Hovedmålet med denne studien var å undersøke om tap av eksopolysakkarider påvirker bakteriofagfølsomheten hos ulike stammer av Lactococcus lactis. I tillegg ble tilstedeværelsen av bakteriofager som angriper epsD-negative stammer undersøkt i kommersielle syrekulturer, ettersom en sjelden finner epsD-negative stammer i syrekulturer. EpsD er et gen som er involvert i syntesen av eksopolysakkarider, og epsD sekvensen varierer svært mye mellom ulike stammer av Lactococcus lactis. Det er også kjent at eksopolysakkarid-genene kan tapes ved gjentatte kultiveringer.

16 stammer av Lactococcus lactis subsp. lactis og Lactococcus lactis subsp. cremoris ble valgt ut basert på deres forskjell i epsD sekvens. Disse stammene har tidligere blitt isolert fra en syrekultur som meierier ofte bruker under produksjon av ost. Stammene ble kultivert jevnlig for å undersøke om de kunne miste epsD spontant. Syv epsD-positive stammer mistet epsD ved gjentatte kultiveringer. Det ble brukt 144 isolerte bakteriofager/meieriprøver for å undersøke stammenes sensitivitet for bakteriofager ved hjelp av plaque assay. Bakteriofagene har tidligere blitt isolert fra prøver fra brukssyren hos ulike TINE meierier. Ved plaque assay ble det påvist forskjeller i sensitiviteten mellom ulike stammer, men også forskjeller i sensitiviteten mellom epsD-negative stammer og epsD-positive morstammer. For noen stammer viste epsD-negativ stamme mer sensitivitet til bakteriofager enn epsD-positiv morstamme. For andre stammer viste epsD-negativ stamme mindre sensitivitet til bakteriofager enn epsD-positiv morstamme. En stamme utviklet full resistens mot de undersøke bakteriofagene ved tap av eksopolysakkarider.

For undersøkelse av bakteriofager i kommersielle syrekulturer som angriper epsD-negative stammer ble syrekulturen anriket på epsD-negative stammer av Lactococcus lactis. Det ble isolert bakteriofager fra syrekulturen, og de ble identifisert til å tilhøre gruppe 936 ved hjelp av PCR. PCR-produktene ble sekvensert, og sekvensene var identiske med en tidligere sekvensert bakteriofag. Dette var en φ844 bakteriofag som tidligere har blitt isolert fra brukssyren fra TINEs meierier under produksjon av ost. Denne brukssyren ble produsert fra den samme syrekulturen som ble brukt i denne studien til å undersøke forekomsten av bakteriofager i kommersielle syrekulturer. Dette viser at den kommersielle syrekulturen i seg selv kan være en viktig bidragsyter til bakteriofagproblemer i meieriene.

Resultatene fra denne studien tyder på at eksopolysakkarider spiller en rolle når det gjelder bakteriofagfølsomhet. Eksopolysakkarider ser ut til å ha en funksjon i å beskytte bakterier mot bakteriofager, men det ser også ut til at tilstedeværelse av eksopolysakkarider gir økt sensitivitet til bakteriofager. Bakteriofager tilhørende gruppe 936 ble påvist i kommersielle syrekulturer, selv om det tidligere er antatt at de ikke er til stede. Dette kan ha stor betydning for meieriindustrien da det er problematisk at bakteriofager er til stede allerede i syrekulturene.

Exopolysaccharides are produced by many bacteria, including Lactococcus lactis. It has been discussed whether exopolysaccharides can protect bacteria against bacteriophage attacks. The main objective of the following study was to investigate whether loss of exopolysaccharides affects the bacteriophage sensitivity of different strains of Lactococcus lactis. In addition, the presence of bacteriophages attacking epsD-negative strains was investigated in commercial starter cultures. EpsD is a gene involved in the synthesis of exopolysaccharides, and epsD shows a high degree of sequence variation between different strains of Lactococcus lactis. It is also known that the exopolysaccharide genes can be lost by serial transfers.

16 strains of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris were chosen based on their difference in the epsD sequence. These strains have previously been isolated from a starter culture that dairies often use during cheese production. The strains were cultivated regularly to investigate whether they could lose epsD spontaneously. Seven epsD-positive strains lost their epsD by serial transfers. 144 samples of isolated bacteriophages/bulk starter culture/whey were used to investigate the strains sensitivity for bacteriophages. This was done by using plaque assay. These bacteriophages have been isolated from samples from the bulk starter culture at different TINE dairies. The use of plaque assay showed a difference in sensitivity between different strains, but also showed a difference in sensitivity between epsD-negative strains and their epsD-positive mother strains. For some strains, the epsD-negative strain appears to be more sensitive to bacteriophages than their epsD-positive mother strain. Whereas for other strains it appears that the epsD-negative strain is less sensitive to bacteriophages than the epsD-positive mother strain. One strain developed resistance against bacteriophages with the loss of exopolysaccharides.

To investigate the presence of bacteriophages in commercial starter cultures that attack epsD-negative strains, the starter culture was enriched on the epsD-negative strains of Lactococcus lactis. By using PCR, the isolated bacteriophages from the starter culture were identified as belonging to group 936. The PCR products were sequenced and the sequences were identical to one previously sequenced bacteriophage. This was a φ844 bacteriophage which previously had been isolated from the bulk starter culture from TINE dairies during the production of cheese. The bulk starter culture was produced from the same starter culture that was used in this study to investigate the occurrence of bacteriophages in starter cultures. This shows that the commercial starter culture itself can be an important contributor to bacteriophage problems in dairies.

The results from this study indicate that exopolysaccharides play a role in bacteriophage sensitivity. Exopolysaccharides appear to have a function in protecting bacteria against bacteriophages, but they also appear to increase the sensitivity for bacteriophages. Bacteriophages belonging to the group 936 were detected in commercial starter cultures, although it was previously assumed that they were not present. This can be of great importance to the dairy industry as it is problematic that bacteriophages are present already in the starter cultures.