Vis enkel innførsel

dc.contributor.advisorSørlie, Morten
dc.contributor.advisorBissaro, Bastien
dc.contributor.authorBjølgerud, Helene
dc.date.accessioned2018-08-22T10:56:21Z
dc.date.available2018-08-22T10:56:21Z
dc.date.issued2018
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11250/2558818
dc.description.abstractThe transition to a more environment-friendly economy has spurred the research on how to efficiently convert recalcitrant polysaccharides into soluble sugars. One of the major breakthroughs in the field has been the discovery of enzymes capable of disrupting the crystalline structures of polysaccharides. These enzymes, often referred to as lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), are able to oxidize recalcitrant polysaccharides such as chitin and cellulose and play thus an important role in biomass conversion. Today, LPMOs are classified in families AA9, 10, 11, 13, 14 and 15 in the Carbohydrate-Active Enzymes database. The AA10 family is composed of LPMOs that are mainly of bacterial origin and that present the particularity to be active either on chitin, or on cellulose, or on both. Understanding the evolutionary divergence in substrate specificity (EDSS) among the AA10s would allow for a better understanding of the molecular basis of LPMO catalysis, and also to improve our capacity to predict the enzymatic phenotype of an LPMO based on its sequence. To tackle this question, the natural diversity of AA10s sequences has been analyzed in order to pinpoint potential “hotspot” residues involved in the EDSS via a so-called “correlated mutation analysis” (CMA). In this work, a chitin-active AA10 from the gram-negative bacterium Cellvibrio japonicus (CjAA10A) was selected as a starting model enzyme. The aim of this research is to evolve CjAA10A from a chitin-active phenotype towards a cellulose-active one. Importantly, CjAA10A is a multi-modular enzyme composed of a catalytic domain linked to several carbohydrate binding modules (CBMs) that are specific on chitin. In this context, a first phase of the project consisted in engineering a platform enzyme by exchanging the chitin-specific CBMs of CjAA10A for a cellulose-specific CBM. The catalytic domain of the resulting platform hybrid enzyme (i.e. chitin-active catalytic domain and cellulose-binding CBM) was then subjected to site-directed mutagenesis by targeting the “hotspot” residues identified via the CMA evocated above. Cloning, expression, purification and characterization of different variants of CjAA10A, with shuffled linkers and CBM domains, were successful. The binding and activity of the variants were analyzed by MALDI-TOF MS and HPLC in order to identify how the changes introduced were affecting the enzyme properties. In addition, the H2O2 production ability of each enzyme was quantified.nb_NO
dc.description.abstractOvergangen til en mer bærekraftig bioøkonomi har satt fart på forskning tilknyttet effektiv konvertering av vanskelig nedbrytbare polysakkarider til løselige sukkerarter. Et stort gjennombrudd innen dette feltet har vært oppdagelsen av enzymer som kan bidra til depolymerisering av krystallinske polysakkaridstrukturer. Disse enzymene, ofte referert til som lytiske polysakkarid monooksygenaser (LPMOer), kløyver glykosidiske bånd i polysakkaridkjedene ved oksidasjon, og spiller dermed en viktig rolle i biomassekonvertering. LPMOer er i dag klassifisert i familiene AA9, 10, 11, 13, 14 og 15 i databasen for karbohydrat-aktive enzymer, CAZy. AA10 familien består i hovedsak av LPMOer av bakteriell opprinnelse som er substratspesifikke til enten kitin, cellulose eller begge. Forståelsen av den evolusjonære divergensen i substratspesifisitet (EDSS) blant AA10ene vil gi en bedre forståelse av det molekylære grunnlaget for LPMO katalyse, men også for å bedre vår evne til å forutsi den enzymatiske fenotypen av LPMOer basert på deres sekvens. Det naturlige mangfoldet av AA10-sekvenser har blitt analysert for å identifisere potensielle “hotspot”-residuer involvert i EDSS via en såkalt “korrelert mutasjonsanalyse” (CMA). I denne studien har en kitin-aktiv AA10 fra den gram-negative bakterien Cellvibrio japonicus (CjAA10A) blitt valgt ut som et startmodell-enzym. Målet med denne studien var å utvikle CjAA10A fra en kitin-aktiv fenotype mot en cellulose-aktiv fenotype. CjAA10A er et multimodulært enzym bestående av et katalytisk domene koblet via en linker til flere karbohydratbindende moduler (CBMer) som er spesifikke til kitin. CBMer har vist seg å være avgjørende for LPMO-stabilitet under katalyse. I denne konteksten bestod den første fasen i prosjektet av å konstruere et plattformenzym ved å bytte den kitin-spesifikke CBMen til CjAA10A med en cellulose-spesifikk CBM. Det katalytiske domenet til den resulterende plattformenzymet (dvs. kitin-aktivt katalytisk domene med cellulose-bindende CBM) ble så utsatt for seterettet mutagenese ved å velge “hotspot” residuene identifisert via den tidligere nevnte korrelert mutasjonsanalysen. Kloning, utrykking, rensing og karakterisering av forskjellige varianter av CjAA10A med endrede linkere og CBM-domener var vellykkede. Binding og aktivitet hos varianter ble analysert ved MALDI-TOF MS og HPLC for å identifisere hvordan de innførte endringene påvirket enzymegenskapene. I tillegg ble H2O2-produksjonsevnen til hvert enzym kvantifisert.nb_NO
dc.language.isoengnb_NO
dc.publisherNorwegian University of Life Sciences, Åsnb_NO
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.no*
dc.subjectLPMOnb_NO
dc.titleMolecular evolution of the substrate specificity of bacterial lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs)nb_NO
dc.typeMaster thesisnb_NO
dc.source.pagenumber108nb_NO
dc.description.localcodeM-BIOTEKnb_NO


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel

Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal
Med mindre annet er angitt, så er denne innførselen lisensiert som Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal