Funksjonelle studier av ComM, et immunitetsprotein som beskytter Streptococcus pneumoniae mot fratricinet CbpD

Abstract

Streptococcus pneumoniae er en opportunistisk patogen bakterie, og infeksjoner av denne kan føre til alvorlige sykdommer som lungebetennelse, blodforgiftning (sepsis) og hjernehinnebetennelse. S. pneumoniae er naturlig kompetent for genetisk transformasjon, noe som fører til at bakterien hurtig tilpasser seg endringer i dens naturlige habitat, og på denne måten kan tilegne seg nye egenskaper, som for eksempel økt resistens mot ulike antibiotikum. Kompetanse hos S. pneumoniae er en nøye regulert prosess som blir indusert av det kompetanse stimulerende peptidet CSP. Kompetente pneumokokker benytter seg av en mekanisme kalt fratricide (broderdrap) for å erverve homologt DNA fra nært beslektede ikke-kompetente celler. Hovedkomponenten i fratricide-mekanismen er fratricinet CbpD, som angriper ikkekompetente celler i septum, og lyserer disse. For at kompetente celler ikke skal begå «selvmord», uttrykker de immunitetsproteinet ComM. ComM er et membranprotein som har en ukjent funksjon utover at det beskytter kompetente celler mot CbpD. På bakgrunn av dette ble hovedmålet for denne oppgaven å undersøke funksjonen til immunitetsproteinet ComM nærmere. Dette ble gjort ved å innføre punktmutasjoner i konserverte regioner i aminosyresekvensen til ComM, for å undersøke om disse hadde noen effekt på immunitetsfunksjonen. Det ble også undersøkt om ComM fra andre streptokokkarter kunne gi immunitet mot CbpD hos S. pneumoniae, og om ComM kunne være en antagonist for CAAXproteaser, da disse deler noe homologi. Fordi CbpD angriper celleveggen i septum, ble ComM også testet for protein-protein interaksjoner med proteiner som er viktige i celledelingen eller celleveggsyntesen. Det ble i tillegg gjort forsøk på å lokalisere GFP-ComM i cellen under celledeling. Resultatene fra denne oppgaven viste at aminosyrer i de konserverte regionene hos ComM var viktige for proteinets immunitetsfunksjon. ComM fra nært beslektede arter ga immunitet mot CbpD hos S. pneumoniae, mens ComM fra fjernere beslektede streptokokker ikke hadde denne egenskapen. Dette styrker teorien om at fratricide-mekanismen er utviklet for kontrollert opptak av DNA fra nært beslektede arter. ComM ble ikke identifisert som en antagonist for CAAX-proteaser. Protein-protein interaksjoner indikerte at ComM er assosiert med de tre PBP’ene PBP2b, PBP2x og PBP1b, som alle er viktige i celledelingsmaskineriet hos S. pneumoniae, men det er usikkert om disse resultatene er reelle da det ikke så ut til at ComM ble integrert i membranen hos E. coli, som ble brukt som ekspresjonsvert. En distinkt subcellulær lokalisering av GFP-ComM ble ikke observert. Det kan ikke trekkes noen klare konklusjoner fra arbeidet utført i denne oppgaven, men resultatene peker mot at ComM har en enzymatisk- eller substratbindende aktivitet.

Streptococcus pneumoniae is an opportunistic pathogen bacteria, and infections of this bacteria can lead to severe illnesses like pneumoniae, sepsis and meningitis. S. pneumoniae is naturally competent for genetic transformation, which makes it rapidly adaptive to changes in its natural habitat. In this way, the bacteria can evolve new properties, like resistance to various antibiotics. Competence in S. pneumoniae is a highly regulated process, induced by the competence stimulating peptide CSP. Competent pneumococci utilize a mechanism termed fratricide, to achieve homologous DNA from closely related non-competent cells. The main component of the fratricide-mechanism is the fratricine CbpD, which attacks non-competent cells in septa, resulting in cell lysis. To avoid competent cells in committing suicide, they express the immunity protein ComM. ComM is a membrane protein, with an unknown function except from the fact that it protects the competent cells from CbpD. With this background, the main goal of this thesis was to investigate the function of the immunity protein ComM closer. To do this, point mutations were introduced in conserved regions of the amino acid sequence to ComM, to investigate if these influenced the immunity function. ComM from other streptococci were analyzed for immunity against CbpD in S. pneumoniae, and the theory of which ComM could possibly be an antagonist for CAAX proteases (due to some shared homology) was tested. Because CbpD attacks the cell wall in septa, ComM was also tested for protein-protein interactions with proteins that are important for the cell division or the cell wall synthesis. Attempts to localize GFP-ComM in cells in cell division were also carried out. The results in this thesis identified amino acids in the conserved regions of ComM to be important for its immunity function. ComM from closely related species gave immunity to CbpD in S. pneumoniae, while ComM from the more distant related streptococci did not. This strengthens the theory of which the fratricide mechanism is developed for controlled uptake of DNA from closely related species. ComM was not identified as an antagonist for CAAX proteases. Proteinprotein interactions indicated ComM in an association to the three PBP’s PBP2b, PBP2x and PBP1b, all of which are of importance for the cell division machinery in S. pneumoniae, but it is not clear whether the results are real, as ComM did not seem to integrate in the membrane of E. coli, which was used as an expression host. A distinct sub cellular localization of GFP-ComM was not found. No clear conclusions can be drawn from the work of this thesis, but the results points in the direction of ComM having an enzymatic or substrate binding activity.