Paracetamol : an inhibitor of Sorbitol dehydrogenase?

Abstract

Paracetamol is one of the most common used analgesics and antipyretics in the world. Still, its exact mechanisms of action are unknown. Sorbitol dehydrogenase is an enzyme that catalyze the oxidation of the polyhydric alcohol D-sorbitol to D-fructose. Sorbitol dehydrogenase uses NAD+/ NADH as a coenzyme. The work of this thesis has been a research on whether paracetamol can be an inhibitor of sorbitol dehydrogenase, and eventually what kind of inhibition it would be, and whether it binds to the active site. AutoDock Vina was to be used to verify the results from laboratory work. Experimental work has been done in the laboratory, using spectrophotometric methods to find the maximum rate, Vmax, and the affinity value KM of the reaction where D-sorbitol is oxidized to D-fructose, both in the presence of paracetamol and without, at pH 9.9. Four series of 10 reaction samples were made, where the series had an increasing paracetamol concentration, and the 10 reaction samples of each series had increasing D-sorbitol concentration. In addition to D-sorbitol and paracetamol, each reaction sample contained 50mM NAD+ and glycine buffer (pH 9.9). The initial reaction rate for each of the reaction solutions was estimated by measuring the change in absorbance by NADH at 340nm over a period of ten seconds, shortly after the enzyme was added to the reaction solution. A Lineweaver-Burk plot was used to find Vmax and KM for each of the four series, and to see whether paracetamol influences Vmax and KM for the reaction. The results indicate that paracetamol is indeed an inhibitor of sorbitol dehydrogenase. The results from the laboratory work show that both the maximum velocity of the reaction, as well as the enzyme’s affinity for the substrate D-sorbitol changes in the presence of paracetamol. The results from the docking in AutoDock Vina verifies that paracetamol has a great binding affinity to the active site of sorbitol dehydrogenase, where it binds, along with the coenzyme NAD+/ NADH, towards the catalytic zinc atom. It is not clear given the results what kind of inhibition the paracetamol present to the sorbitol dehydrogenase. However, they might indicate that there is a form of mixed inhibition.

Paracetamol er et av de mest brukte analgetika i verden. Likevel er dens eksakte funksjons-mekanisme ukjent. Sorbitol dehydrogenase er et enzym som katalyserer oksidasjonen av sukkeralkoholen D-sorbitol til D-fruktose. Sorbitol dehydrogenase bruker NAD+/NADH som koenzym. Arbeidet i denne masteren har vært en studie på om paracetamol kan være en hemmer av sorbitol dehydrogenase, og eventuelt hva slags hemming det ville være, og om den binder til det aktive setet. AutoDock Vina er blitt brukt til å bekrefte resultater fra laboratoriearbeidet. Eksperimentelt arbeid er gjort på laboratorium, der spektrofotometriske metoder er blitt brukt til å finne Vmax og KM til reaksjonen der D-sorbitol blir oksidert til D-fruktose, både med paracetamol tilstede og uten, ved pH 9.9. Fire serier med 10 reaksjonsprøver ble laget, der seriene hadde økende paracetamol konsentrasjon, og de 10 reaksjonsprøvene i hver serie hadde økende D-sorbitol konsentrasjon. I tillegg til D-sorbitol og paracetamol inneholdt hver reaksjonsprøve av 50mM NAD+ og glycin buffer (pH 9.9). Den initiale reaksjonshastigheten for hver av reaksjonsløsningene ble estimert ved å måle endringen i absorbans av NADH ved 340nm over ti sekunder, kort tid etter at enzymet sorbitol dehydrogenase ble tilsatt reaksjonsblandingen. Lineweaver-Burk plott ble brukt til å finne Vmax og KM for hver av de fire seriene, og for å se om paracetamol påvirker Vmax og KM for reaksjonen. Resultatene indikerer at paracetamol er en hemmer av sorbitol dehydrogenase. Resultatene fra laboratoriearbeidet viser at både den maksimale reaksjonshastigheten og enzymets affinitet for substratet D-sorbitol påvirkes av tilstedeværelsen av paracetamol. Resultatene fra dockingen i AutoDock Vina bekrefter at paracetamol har en god bindingsaffinitet til det aktive setet til sorbitol dehydrogenase, der den binder, sammen med NAD+/NADH, mot det katalytiske sink-atomet. Det er ikke klart ut fra resultatene hvordan paracetamol hemmer D-sorbitol dehydrogenase. Likevel kan de tyde på at det er en form for «mixed» hemming.