Rational engineering of a family 6 glycoside hydrolase

Abstract

Plant-based lignocellulosic biomass represents a significant global reserve of organic renewable energy, and is considered to have high potential to replace substantial portions of fossil-fuel dependency. Sugars derived from the degradation of lignocellulosic biomass can be utilized in the production of more environmentally-friendly products such as biofuels and numerous other value-added compounds. However, the degradation of the cellulose polysaccharide is complicated by its highly recalcitrant nature resulting from strong intermolecular hydrogen bonds and cross-linkages with other components such as lignin.

A variety of bacteria and fungi have evolved the ability to degrade cellulose through the use of cellulases, -glucosidases, and lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs). Such enzymes are thus the focus of intense research for use in biorefineries that aim to convert woody biomass to soluble sugars. Biorefineries utilize a variety of methods, including enzymatic degradation, to purify and isolate various components from biomass. These industrial processes are often characterized by relatively extreme conditions such as high temperatures and acidic or alkaline pH. There is therefore great interest in improving the properties of cellulases for use under these conditions. One approach is the engineering of cellulases with the aim of altering specific properties such pH stability and/or pH optimum.

The main aim of this study was to use rational protein engineering in an attempt to optimize a family 6 glycoside hydrolase (GH), mgCel6A, for use at pH 5.0 or lower for more than 24 hours at 60C or higher. The mgCel6A wild-type enzyme was extensively characterized to determine its pH optimum and degree of pH stability on the industrial BALI cellulose substrate, as well as on model substrates.

Mutant design aimed at optimizing the pH optimum and stability of mgCel6A was guided by analysis of a homology model of the catalytic domain of the enzyme (mgCel6A∆CBM), a multiple sequence alignment (MSA) of biochemically characterized family 6 GHs, and studies of pH-engineering literature. Mutations were introduced on the surface of the enzyme and in or near the active site. Produced mgCel6A∆CBM enzyme variants (Q152E, L165E, N21D/N46D/A104E/Q152E/L165E/I242E/I271D/Q276E, T44D, D158A, and D158N) were characterized to investigate their pH optima and stability as compared to the wild-type enzyme.

Of the six successfully produced mutant enzyme variants, three appeared to have identical stabilities and pH optima compared to that of mgCel6A∆CBM. One mutant variant with additional negative surface charge (N21D/N46D/A104E/Q152E/L165E/I242E/I271D/Q276E) showed a significant decrease in thermal stability. Two mutants lacking an aspartate presumed to raise the pKa of the catalytic acid (D158A and D158N) showed considerable acidic shifts in their pH-activity profiles. Characterization of these mutants indicated that they had obtained pH optima of approximately 5.0 and 5.5, respectively, for 24-hour reactions at 60C with the BALI™ cellulose substrate. However, the activities of these mgCel6A∆CBM variants were drastically reduced as compared to that of the wild-type enzyme, showing that further optimization of these mutants is most likely needed for optimal performance under industrial conditions.

Future mutagenesis studies of the D158A and D158N mutants may provide a deeper understanding of the reduced catalytic activity, and may also help in designing modified versions of these mutants with preserved reduced pH optima and concomitantly increased activity. A combination of rational engineering and directed evolution may be advantageous in the further development of mgCel6A∆CBM towards industrial use.

Plantebasert lignocellulosisk biomasse utgjør en betydelig global reserve av organisk fornybar energi, og antas å ha stort potensiale til å erstatte mye av det fossile brennstoffet vi i dag er svært avhengige av. Sukker som utvinnes ved nedbryting av lignocellulosisk biomasse kan brukes i produksjonen av mer miljøvennlige produkter slik som biodrivstoff og flere andre foredlede produkter. Nedbryting av cellulose er imidlertid vanskelig grunnet sterke intermolekylære hydrogenbindinger og kryss-linker med andre komponenter slik som lignin. En rekke typer bakterier og sopp har utviklet evnen til å bryte ned cellulose ved hjelp av cellulaser, b-glucosidaser og lytiske polysakkaridmonooksygenaser (LPMOer). Det forskes derfor intenst på disse enzymene for bruk i bioraffinerier hvor målet er å konvertere biomasse til løselige sukkere. Bioraffinerier benytter en rekke metoder, inkludert enzymatisk nedbryting, for å rense og isolere ulike komponenter i biomassen. Disse industrielle prosessene karakteriseres ofte av relativt ekstreme forhold, slik som høye temperaturer og sur eller basisk pH. Det er derfor av stor interesse å kunne forbedre cellulasenes egenskaper til bruk under slike forhold. En tilnærmingsmåte er å utvikle cellulaser med den målsetting å endre spesifikke egenskaper som pH-stabilitet og/eller pH-optimum. Hovedformålet med denne oppgaven har vært å bruke rasjonell protein engineering i et forsøk på å optimalisere en familie 6-glykosid hydrolase (GH), mgCe16A, for bruk ved pH 5.0 eller lavere og ved 60°C eller høyere, i mer enn 24 timer. mgCel6A ble karakterisert for å bestemme villtypeenzymets pH-optimum og grad av pH-stabilitet på det industrielle BALIÔ cellulose-substratet og på modellsubstrater. Mutantdesign med mål om å optimalisere enzymets pH-optimum og stabilitet var basert på analyse av en homologimodell av det katalytiske domenet av enzymet (mgCel6AΔCBM), en multippel sekvenssammenstilling av biokjemiske karakteriserte familie 6-GHer, og pHengineering litteratur. Mutasjoner ble introdusert både på overflaten av enzymet, samt i og i nærheten av det aktive setet. Produserte mgCel6AΔCBM mutanter (Q152E, L165E, N21D/N46D/A104E/Q152E/L165E/I242E/I271D/Q276E, T44D, D158A, og D158N) ble deretter testet for å undersøke deres pH-optimum og stabilitet sammenliknet med villtypeenzymet. Tre av seks produserte mutanter viste like stabiliteter og pH-optima som villtypeenzymet. En av mutantvariantene av mgCe16AΔCBM med flere negative ladninger på overflaten (N21D/N46D/A104E/Q152E/L165E/I242E/I271D/Q276E) viste en betydelig reduksjon i termostabilitet. To andre mutanter som manglet en aspartat (antatt å øke pKa verdien til den katalytiske syren; mutanter D158A og D158N), fikk betydelig lavere pH-optima. Karakterisering av disse mutantene indikerte at de hadde pH-optima på rundt 5.0 og 5.5 i en 24-timers reaksjon ved 60°C på BALIÔ substratet. Imidlertid var aktiviteten til disse mutantvariantene av mgCel6AΔCBM betydelig redusert i forhold til villtypeenzymet. Resultatene indikerer at videre optimalisering av disse mutantvariantene er nødvendig for optimal ytelse ved industrielle betingelser. Fremtidige mutagenesestudier av mutantene D158A og D158N kan gi en dypere forståelse av den reduserte katalytiske aktiviteten, og kan også være til hjelp i design av modifiserte versjoner av disse mutantene med tilsvarende redusert pH-optimum og økt aktivitet. En kombinasjon av rasjonell design og styrt evolusjon (directed evolution) kan være fordelaktig i videre utvikling av mgCel6AΔCBM for industrielle forhold.