Secretion and anchoring of a cancer antigen in Lactobacillus plantarum

Abstract

Melanoma is one of the most lethal forms of skin cancer, and immunotherapy continues to be a hot topic for the treatment of this disease. This study is part of a larger project with the long-term goal to develop mucosal vaccines utilizing lactic acid bacteria (LAB) as delivery vectors of antigens. LAB have been exploited in the preservation of food for centuries. In addition to their status as generally recognized as safe (GRAS), LAB meet many of the requirements of a potential vector for delivery of antigens to mucosal sites. Many of these bacteria have a tolerance for low pH, and are natural inhabitants of the gastrointestinal tract. Furthermore, studies of Lactobacillus plantarum have indicated that this bacterium has immunological adjuvant effects, making it a good candidate for delivery of antigens with the aim of inducing immunity against pathogens or even cancer.

MART-1/Melan-A is an antigen found on the surface of melanocytes and cells of melanocytic lineage. This antigen has been shown to have potential as a cancer vaccine candidate due to its potential to generate tumor specific immune responses. In the present study, we have constructed plasmids for secretion and surface display of MART-1 on L. plantarum. It has previously been shown that the amino acid substitution A27L in the MART-1 epitope recognized by T cells elicits a stronger immune response compared to the native MART-1 epitope. Therefore, the modified epitope was translationally fused to the C-terminal end of the open reading frame of the native MART-1 protein. In addition, adjuvants are often necessary to induce an adequate immune response, thus a dendritic cell (DC) binding peptide was also incorporated into the translated protein. The recombinant fusion protein was denoted modMART1. Six plasmids for the expression of this protein were constructed to facilitate either secretion or surface anchoring of the cancer antigen. These included two lipoprotein anchors directing the protein to the cell membrane, a covalent anchor bound to the cell wall via a LPxTG (sortase) anchor, and a non-covalent anchor bound to the cell wall by a LysM domain, in addition to two plasmids for the secretion of modMART1_DC.

The bacteria harboring the different modMART1_DC containing plasmids were characterized according to their ability to produce the recombinant protein in terms of viability and surface localization. Successful production was verified through Western blot analysis for all constructs. Surface localization of the antigen was investigated through flow cytometry and immunofluorescent microscopy, and was confirmed for the lipoprotein anchors and LPxTG (sortase) anchor cell wall anchor after lysozyme treatment. Interestingly, no secreted antigen was observed in the culture supernatant from recombinant L. plantarum harboring the secretion plasmids. Subsequent lysozyme treatment, flow cytometry and immunofluorescent microscopy indicated that modMART1_DC was retained in the cell wall. modMART1_DC was also purified from an E. coli BL21 expression host to semi-quantify the amount of antigen produced by each construct, as knowledge of the amount of antigen administered is of great importance in a potential vaccine trial. The successful surface exposure of the antigens, alongside the continued viability of the Lactobacillus strains, indicate that the recombinant bacteria have potential as delivery vectors of MART-1 antigens to mucosal sites.

Dette studiet er del av et større prosjekt med det langsiktige målet å utvikle vaksiner med melkesyrebakterier som leveringsvektorer av terapeutiske proteiner og antigener til det slimhinne-assosierte immunforsvaret. Melkesyrebakterier har lenge blitt utnyttet i bevaringen av mat, og mange arter anses derfor som helt trygge for konsum. Det er også blitt vist at mange arter av melkesyrebakterier har probiotiske effekter på verten. Dette, i tillegg til at mange er en del av den naturlige tarmfloraen hos mennesker, gjør melkesyrebakterier til gode kandidater for leveringsvektorer av antigener. En av artene som det er forsket mye på er Lactobacillus plantarum, og studier har indikert at denne arten kan inneha immunomodulerende egenskaper som gjør den til en attraktiv kandidat som leveringsvektor av antigener med målet å indusere immunitet mot patogene mikroorganismer og til og med kreft. MARTt-1/Melan-A er et protein uttrykt i melanocytter, og antigener fra dette proteinet har blitt vist å bli gjenkjent av cytotoksiske T celler som angriper kreftceller. Å indusere en videre immunrespons mot dette antigenet har derfor blitt ansett som en god strategi for å bekjempe føflekkreft. I dette studiet har vi konstruert plasmid for sekresjon og ankring av et modifisert MART-1 protein på overflaten av L. plantarum. Det har tidligere blitt vist at en aminosyresubstitusjon fra alanin til leucin (A27L) i epitopen gjenkjent av cytotoksiske T celler, øker immunresponsen. Derfor ble denne epitopen translasjonelt koblet sammen til den C-terminale delen av den åpne leserammen til det native MART-1 proteinet. I tillegg ble et dendrittisk cellebindende peptid inkorporert i proteinet for å forsterke en eventuell immunrespons ved å øke sjansen for å bli tatt opp av dendrittiske celler. Proteinet ble kalt modMART1_DC, og totalt seks plasmider ble konstruert: to lipoproteinankere som ville føre til ankring til cellemembranen, et kovalent anker bundet til celleveggen via et LPxTG (sortase) anker, et ikke-kovalent anker bundet til celleveggen via et LysM domene, og til slutt to sekresjonsplasmider. De rekombinante bakterienes evne til å produsere proteinet og proteinets overflatelokalisering ble deretter undersøkt. Proteinuttryk ble verifisert for alle konstruktene gjennom Western blot analyse. Proteinet overflatelokasjon ble undersøkt med strømningscytometri og immunofluorosensmikroskopi, og ble bekreftet for lipoproteinankerene og det kovalente LPxTG celleveggsankeret etter lysozymbehandling. Imidlertid ble ikke sekretert antigen funnet i supernatantene til L. plantarum med sekresjonsplasmider. Påfølgende lysozymbehandling, strøminingscytometri og immunofluroesensmikroskopi indikerte at modMART1_DC var fanget i celleveggen til bakterien. I tillegg ble modMART1_DC uttrykt i en overekspresjonsstamme, E. coli BL2, for å isolere rent modMART1_DC protein som kunne brukes til å fastslå et semi-kvantitativ estimat av hvor mye antigen hver bakterie med ulike plasmider produserte. Dette er viktig å vite i et potensielt vaksineeksperiment, da det er nødvendig å vite hvor mye antigen som blir administrert. Den vellykkede produksjonen og ankringen av modMART1_DC på overflaten av L. plantarum indikerer at denne bakterien har potensiale til å brukes som leveringsvektor av kreftantigener til det slimhinneassosierte immunforsvaret for å indusere immunitet.