Kitin depolymerisering og selektiv hydrokarbonoksidasjon : enzymatisk foredling av naturressurser

Abstract

Kitin er et polysakkarid bestående av N-acetylglukosamin enheter som kobles sammen med β(1→4) glykosidbindinger. CBP21, en lytisk polysakkarid monooksygenase (LPMO), bryter glykosidbindinger i kitinpolymeren med en oksidativ mekanisme som fører til mindre krystallinitet. Depolymerisering av β-kitin har blitt forsøkt med og uten forbehandling av substratet med CBP21 for både villtype og aromat til alanin mutanter av kitinasene human chitotriosidase (HCHT) fra menneske og kitinase B (ChiB) fra den gram negative bakterien Serratia marcescens. Eksperimenter har blitt utført for ChiB mutantene W220A, W97A/W220A, HCHT-50 mutantene W31A, W99A, W218A, samt isoformen HCHT-39 uten karbohydrat bindende domene. Tidligere studier har vist at aromatiske aminosyrer nærliggende det aktive setet er viktige for grad av depolymerisering, effektiviteten til depolymeriseringen og prosessiviteten. Det er også vist at prosessivitet kan gå på bekostning av effektiviteten til kitinaser. Aromat til alanin mutanter, som er mindre prosessive, har vist seg å være effektive i depolymerisering av mindre krystallinsk kitin.

Resultatene viser at kitinase aktiviteten er høyere på mindre krystallinsk kitin. Effekten av mindre krystallinsk kitin er større for ChiB enn HCHT og større for aromat til alanin mutantene sammenlignet med villtype for både ChiB og HCHT. Tidligere forsøk har vist at ChiB mutanten i subsete +2, W220A, er mer effektiv enn villtype på mindre krystallinsk kitin. Samme resultat observeres for HCHT-50 mutanten W218A som også er posisjonert i subsete +2, men resultatet for HCHT-50 er noe mer usikkert. I forsøk med H2O2 direkte tilsatt i reaksjonsblandingen observeres ikke den samme trenden at ChiB W220A er mer effektiv en ChiB WT med forhandling av CBP21. For ChiB WT og W220A har også effekten av ulike typer β-kitin blitt undersøk og kitintypene viser samme trend, men verdien på aktivitets parametere er ulik. Sammenligning av HCHT-39 WT og HCHT-50 WT viser en øking i kitin depolymerisering med karbohydrat bindende domene.

Hydrokarboner består av atomene karbon og hydrogen. Funksjonalisering i form av kontrollert selektiv oksidasjon av hydrokarboner er en utfordring da produktene har tendens til overoksidasjon og dannelse av CO2 isteden for verdifulle intermediater. Dagens metanol produksjon er energikrevende og ineffektiv og det er stor kommersiell interesse av en direkte katalytisk rute fra metan til metanol. LPMOer sin evne til selektiv oksidasjon av hydrokarboner har blitt undersøk basert på likheter i aktiv sete geometri med metan monooksygenase (MMO) som katalyserer reaksjonen av metan til metanol. Metan, etan, isobutan, sykloheksan og propen ble benyttet som substrater og en rekke ulike reaksjonsbetingelser er forsøkt. Det ble detektert oksiderte produkter av interesse for samtlige substrater og reaksjonsbetingelser. Resultatene viser en gjennomgående trend hvor prøver som inneholder kobber danner høyere konsentrasjon av oksiderte produkter av interesse enn prøver med LPMO.

Hydrogenperoksid er et postulert kosubstrat for LPMOer. Hydrogenperoksid er en sterk oksidant og høye konsentrasjoner kan oksidere og inaktivere enzymer. Glukoseoksidase (GOX) er et enzym som danner hydrogenperoksid fra glukose. In situ generert hydrogenperoksid fra GOX er tenkt å kunne øke aktiviteten til LPMOer under mildere reaksjonsbetingelser. GOX systemet ble optimalisert mot LPMOen CBP21. Resultatene for optimaliseringen er ikke tilsetrekklige til benyttelse av GOX systemet i forsøk med hydrokarbonoksidasjon eller kitin depolymerisering. Aktivitets økende effekt for CBP21 med hydrogenperoksid generert av GOX observeres.

Chitin is a polysaccharide of N-acetylglucosamin units connected through β-(1→4) glycosidic bonds. CBP21, a lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO), breaks the glycosidic bonds of the chitinpolymer by an oxidative mechanism making it less crystalline. Depolymerisation of β-chitin has been done with and without pre-treatment of the substrate by CBP21 for both the wildtype and aromat to alanine mutants of the chitinases human chitotriosidase (HCHT) from humans and chitinase B (ChiB) from the gram negative bacteria Serratia marcescens. Experiments with the ChiB mutants W220A, W97A/W220A, the HCHT-50 mutants W31A, W99A, W218A, and the isoform HCHT-39 without a carbohydrate binding domain have been performed. Previous studies have shown that aromatic amino acids close to the active site are important for degree of depolymerisation, the efficiency of depolymerisation and the processivity. It is also shown that processivity can have a cost in terms of efficiency. Aromat to alanine mutants, that are less processive, are showing high efficiency in depolymerisation of less crystalline substrates.

The result shows that chitinase activity is greater on less crystalline substrate. The effect of less crystalline chitin is greater for ChiB than HCHT and greater for the aromat to alanine mutants compared to the wildtype for both ChiB and HCHT. Previous studies have shown that ChiB with a mutation in subsite +2, W220A, is more efficient that the wildtype on less crystalline chitin. The same result is observed for the HCHT-50 mutant W218A that is also positioned in subsite +2, but there is more uncertainty about result for HCHT-50. The same trend is not observed in experiments with ChiB WT and ChiB W220A with pre-treatment by CBP21 where H2O2 was added directly to the reaction mixture. The effect of different kinds of β-chitin has also been tested for ChiB WT and ChiB W220A. The results showing the same trend, but the amount activity observed is different. A comparison of the HCHT-39 WT and HCHT-50 WT shows an increase in chitin depolymerisation with the carbohydrate binding domain.

Hydrocarbons consist of the atoms carbon and hydrogen. Functionalization by controlled selective oxidation of hydrocarbons is challenging because the products have a tendency to over oxidize and produce CO2 instead of valuable intermediates. Methanol production today is energy intensive and inefficient and a direct route from methane to methanol is of great commercial interest. LPMOs ability to selectively oxidize hydrocarbons has been investigated based on similarities in active site geometry with methane monooxygenases (MMO) that are catalyzing the reaction methane to methanol. Methane, ethane, isobutane, cyclohexane and propene have been used as substrates and the reactions have been performed under different conditions. The result shows a trend where samples containing copper is producing more oxidized products of interest the samples containing LPMOs.

Hydrogen peroxide is possibly the cosubstate for LPMOs. Hydrogen peroxide is strongly oxidizing and high concentrations can oxidize and inactivate enzymes. Glucose oxidase (GOX) is an enzyme that produces hydrogen peroxide from glucose. In situ generated hydrogen peroxide by GOX is thought to increase the LPMO activity under milder reaction conditions. The GOX system was optimized towards CBP21. The optimization results were not sufficient enough to use the GOX system in experiments for either hydrocarbon oxidation or chitin depolymerisation. An increase in activity for CBP21 is observed with hydrogen peroxide generated by GOX.