Risk assessment of BRCA1 variants with unknown clinical significance

Abstract

Brystkreft er den mest utbredte kreftformen blant kvinner og er ansvarlig for 14 % av kreftrelaterte dødsfall i verden. Omlag 10 % av krefttilfellene kan tilskrives sykdomsgivende kimcellevarianter, av disse stammer 30 % av tilfellene fra skadelige varianter i tumorsuppressorgen BRCA1 og BRCA2. Basesubstitusjoner i BRCA1 er særlig problematiske fra et klinisk ståsted, da effekten de har på proteinets funksjonalitet ofte er ukjent. Mange patogene varianter i BRCA1 ligger i det BRCA1 C-terminale (BRCT) domenet, et domene nødvendig for nøkkelfunksjoner som homolog rekombinasjon, protein-protein interaksjon og transaktivering (TA). Vi undersøkte transaktiveringsegenskapene til 12 BRCA1 BRCT basesubstitusjonsvarianter med ukjent klinisk signifikans (VUS), på et funksjonelt assay. For å oppnå dette modifiserte vi en dobbel-luciferase transaktiverings analysemetode (TA-metode), til å gi økt prøvemengde og sensitivitet. Vi ønsket også å beskrive brystkreftcellelinjene MDA-MB-231, MDA-MB-436, SUM102 og MCF-7, ved å studere effekten av Doxorubicin og Carboplatin på cellenes levedyktighet sett i forhold til endogent BRCA1 og TP53 status.

Ved å etablere TA-aktivitetsgrenseverdier for høy- og lav-risiko grupper utfra kontroller bestående av kjente patogene og benigne varianter, fant vi at variantene p.Thr1700Thr, p.Gly1709Arg, p.Pro1776Ser, p.Glu1826Leu og p.Arg1835Gln, falt innenfor lavrisiko gruppen. Variantene p.Asp1692Ala, p.Gly1706Arg og p.Val1838Gly viste en fullstendig mangel på TA-aktivitet som samsvarer med patogenitet, og ble dermed plassert i høy-risikogruppen. De fire variantene p.Arg1699Gln, p.Ala1708Val, p.Lys1711Gln og p.Met1783Thr viste intermediær TA-aktivitet. Ved å kombinere våre funn med tilgjengelige data, og tolke dette i samsvar med retningslinjene utarbeidet av American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), foreslår vi følgende klassifisering av variantene: p.Thr1700Thr, p.Pro1776ser, p.Met1783Thr, p.Glu1826Leu og p.Arg1835Gln er sannsynlig benigne (klasse 2) varianter. p.Asp1692Ala, p.Arg1699Gln, p.Gly1706Arg, p.Ala1708Val og p.Val1838Gly er sannsynlig patogene (klasse 4), der p.Arg1699Gln og p.Ala1708Val sannsynligvis representerer patogene varianter med moderat penetrans. Variantene p.Gly1709Arg og p.Lys1711Gln forblir klassifisert som VUSer (klasse 3). Vi kan konstantere at TA-metoden i stor grad er uavhengig av valg av modellcellelinjer og det endogene BRCA1 og TP53 uttrykket, men at forlenget inkubasjonstid gir en signifikant økning i sensitivitet.

Vi oppdaget også at de trippel negative brystkreftcellelinjene MDA-MB-231 og MDA-MB-436, med manglende p53 aktivitet, viste lav sensitivitet ved behandling med Doxorubicin, noe som kan indikere en rolle for p53 i utviklingen av cytostatika resistens. Trippelnegative brystkreftceller viste en økt sensitivitet ved behandling med Carboplatin, sammenlignet med Doxorubicin. Det ble påvist at cellelinjen MDA-MB-436 var bærer av c.604_610dupCGTGTGG, en ny TP53 variant med et tidlig stoppkodon og sannsynligvis et ødelagt p53 protein. Cellelinjen SUM102 viste høy sensitivitet under behandling med både Carboplatin og Doxorubicin, men inneholdt villtype BRCA1 og TP53, noe som kan indikere at den kan ha vært bærer av skadelige varianter i andre gener involvert i DNA reparasjonsmekanismer. Den luminale og hormonreseptor positive cellelinjen MCF-7 viste lav sensitivitet til behandling med Doxorubicin, men økt sensitivitet til Carboplatin med særlig effekt ved økt behandlingstid.

Breast cancer is the most prevalent cancer in women, and is responsible for 14 % of cancer related deaths worldwide. Approximately 10 % of all breast cancers can be attributed to deleterious germline variants. Deleterious variants in tumour suppressor gene BRCA1 are known to cause hereditary breast and ovarian cancer syndrome (HBOC), and together with BRCA2 they account for 30 % of hereditary morbidity. Missense variants in BRCA1 pose a challenge in clinical care, as their effect on protein functionality largely remains unknown. Many of the pathogenic variants found in BRCA1 are located in the BRCA1 C-terminal (BRCT) domain, a domain that is known to be vital for key functions such as homologous repair, protein-protein interactions and transactivation (TA). This led to an investigation of the transactivation ability of 12 BRCA1 variants of unknown clinical significance (VUSs) located in the BRCT domain, on a functional assay to assess their impact on BRCA1. To accomplish this, a modified version of the dual luciferase transactivation activity assay (TA-assay) was utilised, to yield increased sensitivity and sample size. Additionally, the breast cancer cell lines MDA-MB-231, MDA-MB-436, SUM102 and MCF-7 was characterised by investigating the effects of Doxorubicin and Carboplatin treatment on cell viability, with respect to endogenous BRCA1 and TP53 status.

By establishing the TA-activity thresholds for high and low risk groups utilising known benign and pathogenic variants as controls, we found that the variants p.Thr1700Thr, p.Gly1709Arg, p.Pro1776Ser, p.Glu1826Leu and p.Arg1835Gln were within the low risk category. The p.Asp1692Ala, p.Gly1706Arg and p.Val1838Gly variants displayed a complete lack of TA-activity consistent with pathogenic variants, and were categorised as high risk. Variants p.Arg1699Gln, p.Ala1708Val, p.Lys1711Gln and p.Met1783Thr were found to have intermediate TA-activity. By combining our findings with available data, and interpreting them in accordance with the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) guidelines for variant classification, we proposed the following classification of the variants: p.Thr1700Thr, p.Pro1776ser, p.Met1783Thr, p.Glu1826Leu and p.Arg1835Gln as likely benign (class 2) variants. p.Asp1692Ala, p.Arg1699Gln, p.Gly1706Arg, p.Ala1708Val and p.Val1838Gly were likely pathogenic (class 4), while p.Arg1699Gln and p.Ala1708Val likely represented pathogenic variants with moderate penetrance. Variants p.Gly1709Arg and p.Lys1711Gln remained classified as VUSs (class 3). We also report that the TA-assay results were independent in choice of model cell line and endogenous BRCA1 and TP53 status. However, increased incubation time yielded a significant increase in sensitivity.

We found that triple negative breast cancer (TNBC) cells MDA-MB-436 and MDA-MB-231 lacking p53 functionality, displayed decreased sensitivity to doxorubicin, suggesting a role for p53 in drug resistance. The TNBC cell lines displayed higher sensitivity to Carboplatin treatment than Doxorubicin, supporting the notion that treatment of TNBCs with platinum-based cytostatic presents with favourable results. The MDA-MB-436 cells were shown to be homozygous for the novel TP53 variant c.604_610dupCGTGTGG, that resulted in an early stop codon and likely abolished p53 activity. The wild type BRCA1 and TP53 cell line SUM102 displayed high sensitivity to both cytostatic, and it could be that the cells harboured deleterious variants in other DNA damage response genes. The luminal, hormone receptor positive MCF-7 cells proved resistant to the effects of Doxorubicin, but displayed higher sensitivity to Carboplatin, although with a greater dependency on exposure time.