Quorum sensing circuits in Pseudomonas aeruginosa regulate N2O reduction

Abstract

Many bacteria respire in the absence of oxygen through reduction of nitrogen oxides (NOx) in the process called denitrification. Denitrification is the main greenhouse gas emitter by its release of N2O when high amounts of N-fertilizers are applied globally. pH is known to be a regulatory factor for N2O emission, but little is known about how quorum sensing regulates denitrification. When respiratory physiology of denitrifying organisms is studied under a defined set of conditions, their phenotypic traits are encompassed by the term denitrification regulatory phenotype (DRP). Pseudomonas aeruginosa is a model organism, well studied due to its widespread denitrifying and opportunistic pathogenic abilities. Detailed gas kinetics of this proteobacterium was studied to characterize its DRP. DRP of strains from P. aeruginosa (a type strain and PAO1 wild type) were characterized with respect to their denitrification phenotype at different initial oxygen concentrations (0, and 7%). This was done by monitoring O2, CO2, NO2-, NO, N2O and N2 by gas chromatography (GC) and an NO-analyzer during their transition from aerobic respiration to denitrification. This study showed that the denser the culture, the higher the accumulation of N2O during denitrification, and implied that quorum sensing (QS) is mediating the N2O emission from denitrification. The question became whether this occurred due to the regulation by one or both of the AHL systems. Further characterization on how QS regulates the denitrification phenotype was done by monitoring denitrification gases under treatment with AHLs on PAO1 rhlI-lasI- mutant and a QS-inhibitor on its PAO1 parent strain (PAO1-UW). Their transcriptional activities of narG, nirS, norB, and nosZ during transition from aerobic respiration to denitrification were quantified by ddPCR. The gas measurements, as well as cell densities, cell numbers and initial biomass were measured to describe specific aerobic and anaerobic respiration rates (μoxic and μanoxic h-1), cell yields per e-acceptor and mRNA per cell. The results showed that the AHL systems´ regulatory effect on denitrification in PAO1 is inhibiting N2OR activity, most likely on a post-transcriptional level. This was directly due to repression of N2O reductase by the Las quorum sensing system.

Mange bakterier respirerer ved fravær av oksygen gjennom reduksjon av nitrogenoksider (NOx) i en prosess kalt denitrifikasjon. Denitrifikasjon er hoved-klimagass frigjøreren gjennom sitt utslipp av N2O når store mengder N-kunstgjødsel anvendes globalt. pH er en kjent reguleringsfaktor for N2O utslipp, mens quorum sensing (bakterielt kommunikasjonssystem) er en svært lite gjennomsøkt reguleringsmekanisme ved denitrifikasjon. Når respirasjonsfysiologien hos denitrifiserende organismer studeres under definerte forhold, blir de fenotypiske karakterene omfattet av terminen en ”denitrifikasjonsregulatorisk fenotype” (DRP). Pseudomonas aeruginosa er en modellorganisme som er velstudert på grunn av dens utbredte denitrifiserende og opportunistiske patogene egenskaper. Detaljert gasskinetikk av denne proteobakterien ble studert for å karakterisere dens DRP. DRP av stammer fra P. aeruginosa (en type stamme og PAO1 villtypen) ble karakterisert med hensyn til deres denitrifikasjonsfenotype under ulike initielle oksygen konsentrasjoner (0 og 7 %). Dette ble gjort ved overvåkning av O2, CO2, NO2-, NO, N2O og N2 gjennom gasskromatografi (GC) og nitrogen okside-analyse (NOA) under deres overgang fra aerob respirasjon til denitrifikasjon. Dette studiet viste at jo høyere celletettheten var, desto høyere ble N2O akkumuleringen under denitrifikasjon, og antydet at quorum sensing (QS) er medvirkende til N2O utslippet fra denitrifikasjon. Spørsmålet ble om dette skjedde på grunn av reguleringen fra en eller flere AHL systemer. Videre karakterisering av hvordan quorum sensing regulerer denne denitrifikasjonsfenotypen ble gjort ved å overvåke denitrifikasjonsgassene under behandling med ulike AHL på en PAO1 rhIl-lasI- mutant og en QS-hemmer på dens PAO1 forelderstamme. Deres transkripsjons aktivitet av narG, nirS, norB, og nosZ under overgangen fra aerob respirasjon til denitrifikasjon ble kvantifisert ved ddPCR. Gassmålingene, såvel som celletetthet, celletall og initiell biomasse ble målt for å beskrive spesifikk aerob og anaerob respirasjons rate (μoxic and μanoxic h-1), celleutbytte per e- akseptor og mRNA per celle. Resultatene viste at AHL systemenes regulerende effekt på denitrifikasjon i PAO1 hemmer N2OR aktivitet, mest sannsynlig på et post- transkripsjonelt nivå. Dette var direkte på grunn av N2O reduktase-undertrykkelsen ved Las quorum sensing systemet.