En QuEChERS metode for analyse av utvalgte legemidler i avløpsvann

Abstract

Legemiddelrester og produkter til personlig pleie, PPCP, samt deres metabolitter, har de senere årene gitt grunn til bekymring. Dette fordi disse stoffene er identifisert i blant annet avløpsvann, overflatevann og sedimenter, og de identifiserte nivåene har vist skadelig effekt på akvatiske organismer. En hovedvei for legemidler å nå det akvatiske miljøet, er via utløpsvann fra avløpsrenseanlegg. Avløpsrenseanlegg er opprinnelig ikke designet for eliminering av legemiddelrester. Det kreves omfattende overvåkningsmetoder for å kontrollere utslipp og fordelingsmønster i naturen. Oppgavens formål var å utvikle en analytisk metode basert på optimalisering av en «Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe» (QuEChERS) ekstraksjon for kvantitativ analyse av 15 utvalgte legemidler i avløpsvann. Analysen ble utført med en høyoppløselig væskekromatograf koplet til et tandem massespektrometer (HPLC-MS/MS - Agilent Technologies, 1200 series/6460 QqQ). Fastfaseekstraksjon (SPE) med HLB-kolonner ble brukt for opprensning før QuEChERS ekstraksjonen, og for å oppkonsentrere vannprøvene fra 1 L prøve til et eluert sluttvolum på 10 mL. Før videre ekstraksjon ble det eluerte volumet dampet ned med trykkluft, for så å rekonstitueres i 5 mL grad 1 Milli-Q vann fra Millipore. QuEChERS ekstraksjonen ble først optimalisert ved hjelp av rene standarder i Milli-Q vann, før arbeidet med avløpsvannmatriks startet. Parameterne som ble optimalisert var tørkesalt, buffermetode, ekstraksjonsmiddel, ekstraksjonstid og sentrifugeringstid og -hastighet. Videre ble det testet med varierende mengder PSA under dispersiv fastfaseekstraksjonen (dSPE), for å studere eventuelle interaksjoner mellom sorbenten og legemidlene. Det ble benyttet de parameterne som ga høyest sensitivitet for flest mulig forbindelser. Dette uten å påvirke responsen til et legemiddel i tydelig negativ retning. Resultatene viste at tetrasyklin og ciprofloksacin kun kan ekstraheres når Na2SO4 benyttes som tørkesalt. Disse legemidlene vil ved bruk av MgSO4, saltet som benyttes i opprinnelig metode, danne komplekser med Mg2+--ionene. Bufring av pH og tilsetning av Na2EDTA for å hindre kompleksering av tetrasyklin og ciprofloksacin med metallioner, ga ingen fordeler. Dette verken under arbeidet med rene standardløsninger eller matriks. For å holde metoden så enkel som mulig, ble det valgt å gå videre med ubufret metode. Det var tilstrekkelig med en ristetid på 1 minutt ved tilsetning av de forskjellige komponentene for å oppnå en tilnærmet fullstendig ekstraksjon. Sentrifugeringstid ble satt til 5 minutter, og sentrifugeringshastigheten til 1509 g ved ekstraksjonen, og 600 g ved dispersiv fastfase (dSPE)-steget. Ekstraksjonsmetodens egnethet ble vurdert ut fra linearitet, presisjon og nøyaktighet for de 15 legemidlene i avløpsvann. Nøyaktigheten ble vurdert ut i fra tilsynelatende gjenfinning. Det ble satt krav til en R2-verdi ≥ 0,980 og en RSD ≤15 % for å kunne anse lineariteten og presisjonen som god. Videre ble det satt krav til en nøyaktighet der avviket fra reell og estimert konsentrasjon i en prøve var ≤ 10 %. Metoden var å anse som godt egnet for kvantitativ analyse av ketoprofen, sulfametoksazol og trimetoprim i avløpsvann. Den var også godt egnet for den ene internstandarden sulfadoxin-D3, vurdert ut fra resultatene til sulfadoxin. Lineariteten, presisjonen og nøyaktigheten var for nevnte legemidler over kravene som ble satt. Metoden viste likevel flere svakheter. De mest signifikante svakhetene var i forhold til den kromatografiske separasjonen, matrikseffekter, urenheter i standardene og andre interferenser som påvirket deteksjonen i matriks og rene standarder. Nevnte parametere må optimaliseres videre, for at metoden skal kunne regnes som egnet for ekstraksjon og kvantitativ analyse av alle de 15 legemidlene i avløpsvann. Flere forbedringstiltak er foreslått.

Pharmaceuticals and personal care products, PPCP, and their metabolites, have in recent years been a reason of concern. These have been identified in wastewater, surface water and sediments, and the identified levels have shown adverse effects on aquatic organisms. As a main source for environmental PPCP contamination, sewage treatment plants (STPs) and wastewater were identified, draining pollutant effluents into the aquatic environment. Sewage and wastewater treatment plants (STP) are not designed for removal of anthropogenic pollutants. Therefore, for many PPCPs, no significant retention in the treatment process is reported. Comprehensive monitoring programs are required for controlling emissions and distribution patterns. The purpose of this study was to develop an analytical method based upon optimization of a reported Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (QuEChERS) extraction for the quantitative analysis of 15 PPCPs in wastewater. The analysis was performed with high performance liquid chromatography coupled to a tandem mass spectrometer (HPLC-MS/MS - Agilent Technologies, 1200 series/6460, QqQ). Solid phase extraction (SPE) utilizing HLB-columns was used for clean up before the QuEChERS extraction, and for volume reduction of the PPCP residues in the wastewater samples from an original volume of 1 L, to a final volume of 10 mL. The resulting eluate was evaporated under a constant stream of air, and dissolved in 5 mL type 1 Milli-Q water from Millipore, before further extraction. The QuEChERS extraction was first optimized with pure standards in Milli-Q water, before starting with wastewater matrix. The parameters optimized was drying-salt and buffering agent, extraction solvent, extraction time, centrifugation time and -speed. The amount of PSA used in the dispersive solid phase extraction (dSPE) was varied, to investigate how the sorbent interacted with the different PPCPs. The parameters which gave the highest sensitivity for most of the PPCPS, without significantly decreasing the chromatographic performance of other PPCPs, was used. The results clearly showed that it was necessary to use Na2SO4 as a drying salt, and not MgSO4 as used in the original method, when extracting Tetracycline and Ciprofloxacin. Both pharmaceuticals have a capacity for complexation with metal-ions, in that case Mg2+. Neither the results from standards in Milli-Q water, nor the results from wastewater matrix samples, indicated that buffering, or use of Na2EDTA to prevent Tetracycline and Ciprofloxacin from chelating with metal-ions, gave an advantage. Therefore, to keep the method as simple as possible, it was chosen to use an unbuffered approach. No further time for extraction was necessary apart from the 1 minute of shaking after addition of each component. The centrifugation time and speed was 1509 g for the extraction and 600 g for the dispersive solid phase extraction (dSPE), for 5 minutes. Linearity, precision and accuracy, was used to evaluate the quality of the method, for the 15 different PPCPs in wastewater. Accuracy was evaluated from apparent recovery. To conclude with a satisfactory linearity, precision and accuracy the R2-value had to be ≥ 0,980, the RSD ≤15 %, and the deviation for the calculated values in the control samples have to be ≤10 % from the true values. The method was considered as suitable for quantitative analysis of Ketoprofen, Sulfamethoxazole, and Trimethoprim in wastewater, as well as for one of the internal standards used, Sulfadoxin-D3, evaluated from the results of Sulfadoxin. The method showed several weaknesses, the most significant in relation to the chromatographic separation, the matrix effects and the standard impurities and interferences that affected the detection of several of the PPCPs in wastewater matrix and in pure standards. These parameters must be optimized further before the method is considered suitable for extraction and quantitative analysis of the 15 PPCPs in wastewater. Ways to improve the method are suggested.