Establishment and characterization of a gatekeeper mutation for protein kinase D1 and 3

Abstract

Protein kinase D constitutes a novel family of Ser/Thr specific kinases and contains three members; PKD1-3. This protein kinase family has been described to carry out different functions and responses at various locations in the cell through a novel PKC/PKD signal transduction pathway. PKD1 has been reported as a major regulator of ROS mediated signaling, where PKD1 deficiency results in an increased sensitivity to ROS. PKD3 has been reported to be involved in cell cycle regulation, and depletion of PKD3 results in cell cycle malfunction. Due to high homology among the PKDs, it is difficult to identify isoform specific functions. To circumvent this problem an approach termed Analog Sensitive Kinase Technology, developed by Kevan Shokat and his team, can be applied. By mutating the gatekeeper residue within the ATP binding pocket to a residue bearing a smaller side chain, a novel pocket is created within the ATP binding site, that is not found in the wild type kinase. This opens up the possibility for isoform specific inhibition, by using a designed inhibitor (1-Na PP1).

Through a Lenti-virus based expression system, gatekeeper variants of PKD1 and PKD3 were introduced into corresponding deficient cell lines. The introduction of PKD1 gatekeeper variants in PKD1 deficient background, restored PKD1 activity and rescued the deficiency, while the application of the inhibitor restored the cells sensitivity to ROS. The established cell line expressing exogenous PKD3 gatekeeper variant had a low expression but was able to restore normal cell cycle. However, the application of the 1-Na PP1 resulted in cell cycle malfunction, but the failure was not as significant as recorded for PKD3-/-, therefore representing a suboptimal result. Thus we have successfully established stable PKD1-/- cell lines expressing exogenous PKD1 gatekeeper variants that are sensitive to 1-Na PP1 inhibition, but a further experimental evaluation is needed for the PKD3-/- cell lines expressing exogenous PKD3 gatekeeper variant.

Protein kinase D konstituerer en familie av Ser/Thr spesifikke kinaser og har tre medlemmer: PKD1-3. Denne protein kinase familien er involvert i forskjellige funksjoner og responser på diverse lokasjoner i en celle, gjennom en PKC/PKD signal transduksjon. PKD1 har vært rapportert som hovedregulator av ROS-mediert signalisering, hvor PKD1 mangel resulterer i økt sensitivitet til ROS. PKD3 har vært rapportert å være involvert i cellesyklus regulering, hvor PKD3 mangel fører til defekt i cellesyklusen. Det er høy homologi blant PKD familiemedlemmene, som gjør det vanskelig å identifisere isoform spesifikke funksjoner. For å overkomme dette problemet, kan en tilnærming kalt Analog Sensitiv Kinase Teknologi, utviklet av Kevan Shokat og hans team, bli applisert. En mutasjon av gatekeeper-residuet i ATP bindingssetet, til en residu med en mindre sidekjede, vil lage en ny lomme på innsiden av ATP bindingssetet som ikke er funnet i vill-type kinasen, og vil derfor tillate isoform spesifikk inhibering ved bruk av en konstruert inhibitor (PP1 analog).

Gjennom et Lenti-virus basert ekspresjonssystem, var gatekeeper varianter av PKD1 og PKD3 introdusert til tilhørende kinase-manglende cellelinjer (PKD1-/- og PKD3-/-). Introduksjonen av PKD1 gatekeeper-varianter i PKD1-/-, gjenopprettet PKD1 aktivitet og reddet de PKD1 manglende cellene. Ved tilføring av inhibitoren responderte cellene som PKD1-/- og var derfor sensitive mot ROS. Den etablerte cellelinjen som uttrykte eksogene PKD3 gatekeeper-varianter hadde lav ekspresjon, men klarte likevel å gjenopprette normal cellesyklus. Senere amplifisering av inhibitor resulterte i reduksjon av den normale cellesyklusen, men tapet var ikke like signifikant som forutsett. Dermed har vi lyktes med å etablere stabile PKD1-/- cellelinjer som uttrykker eksogene PKD1 gatekeeper-varianter, som er sensitive til PP1 analog inhibering. Videre eksperimentell evaluering er nødvendig for å konkludere responsen til PKD3-/- cellelinjene som uttrykker eksogent PKD3 gatekeeper-varianter.