Rollen til aromatiske residuer i det aktive setet under substratdegradering

Abstract

Denne oppgaven er skrevet som en større del av et forskningsprosjekt, der målet er å tilegne seg kunnskap om enzymatisk nedbrytning av det uløselige karbohydratet kitin. Denne biopolymeren er den nest mest vanlige naturen, etter cellulose. Kitin er N-acetyl-Dglukosaminenheter (GlcNAc), som er koplet ved hjelp av en β-1,4 glykosidbinding. Denne oppgaven er todelt, der den ene delen omhandler den humane kitinasen human chitotriosidase (HCHT) og den andre delen omhandler kitinase A (ChiA) og kitinase B (ChiB) fra Serratia marcescens. Felles for begge delene er at aromatiske residuer i det aktive setet er senter for oppmerksomhet.

I den første delen av oppgaven har enzymkinetiske parametere blitt bestemt for HCHT50W99A og HCHT39-W218A ved hjelp av nedbrytningsforsøk på kitin og kitosan. De samme parameterne har tidligere blitt bestemt for villtype HCHT50 og HCHT39, samt andre mutanter. Dette gir mulighet for en større grad av sammenlikning, for å kunne diskutere rollen til de aromatiske residuene i det aktive setet og den karbohydratbindende modulen. Nedbrytning av kitin ga følgende parametere: kcatapp er 0,120 ± 0,03 for HCHT50-W99A og 0,073 ± 0,004 for HCHT39-W218A, Papp er 11,8 ± 1,3 for HCHT50-W99A og 3,8 ± 0,1 for HCHT39-W218A og degraderingen i prosent er 15,4 ± 0,1 for HCHT50-W99A og 4,8 ± 0,3 for HCHT39-W218A. Nedbrytning av kitosan ga disse verdiene: kcat er 4 for HCHT50-W99A og 17 for HCHT39-W218A og αmax er 0,38 for HCHT50-W99A og 0,50 for HCHT39W218A. Resultatene viser at både de aromatiske residuene i det aktive setet og den karbohydratbindende modulen er svært viktig for funksjonen til HCHT.

I den andre delen av oppgaven er det utført aktivitetsassay på kitin som er forbehandlet med en LMPO kalt CBP21 og ubehandlet kitin med både villtype og mutanter av ChiA og ChiB. Hos ChiA er det i tillegg til villtypen benyttet de to mutantene W167A og W275A, og hos ChiB er det i tillegg til villtypen benyttet mutantene W97A og W220A. Samtlige mutasjoner er av aromatiske aminosyrer i det aktive setet, og disse aminosyrene har en påvirkning på prosessiviteten til enzymet. Flere studier har vist at prosessivitet kan gå på bekostning av hastigheten til enzymet, og at mindre prosessive enzymer er mer effektive på substrater med mindre krystallinsk struktur. Aktivitetsassayene har til hensikt å undersøke om mutanter som har mutert bort aromatiske residuer som er viktige for prosessivitet kan være like effektive eller mer effektive enn villtypeenzymet på substrat som er forbehandlet med CPB21. Resultatene viste at økningen i aktivitet på det forbehandlede substrater kontra det vanlige substratet var høyere for mutantene enn for villtypeenzymene. Effekten var også generelt større hos ChiB. Spesielt interessant er at ChiB-W220A viste seg å være raskere enn ChiBWT når substratet var blitt forbehandlet med CBP21.

This thesis is written as a part of a larger research project, were the main goal is to acquire knowledge about enzymatic degradation of the insoluble carbohydrate chitin. Chitin is the second most abundant biopolymer in nature after cellulose. It consists of N-acetyl-Dglucosamine units, linked with β-1,4-glycosidic bonds. This thesis consists of two parts, where one part concerns a human chitinase Human Chitotriosidase (HCHT). The second part is about Chitinase A (ChiA) and Chitinase B (ChiB) from the gram-negative bacterium Serratia marcescens. Both parts has in common that the aromatic residues in the active site is the center of attention. In the first part of the thesis, a number of enzyme-kinetic parameters has been determined for HCHT50-W99A and HCHT39-W218A by degradation of chitin and chitosan. The same parameters has previously been determined for wildtype HCHT50 and HCHT39, and a number of other mutants. This gives an opportunity to compare and discuss the importance of the aromatic residues in the active site and the carbohydrate-binding module. Degradation of chitin determined the following parameters: kcatapp was 0,120 ± 0,03 for HCHT50-W99A and 0,073 ± 0,004for HCHT39-W218A, Papp was 11,8 ± 1,3 for HCHT50-W99A and 3,8 ± 0,1 for HCHT39-W218A and the degradation given in percent is 15,4 ± 0,1 for HCHT50-W99A and 4,8 ± 0,3 for HCHT39-W218A. Degradation of chitosan determined the following parameters: kcat was 4 for HCHT50-W99A and 17 for HCHT39-W218A and αmax is 0,38 for HCHT50-W99A and 0,50 for HCHT39-W218A. The results show that both the aromatic residues in the active site and the carbohydrate-binding module is of great importance to the function of HCHT. In the second part of the thesis activity-assays has been performed both on chitin that has been pretreated with an LPMO called CBP21 and untreated chitin, with both wildtype and mutants of ChiA og ChiB. The mutants created from ChiA-WT is ChiA-W167A and ChiA-W275, and the mutants created from ChiB-WT is ChiB-W97A and ChiB-W220A. All of these mutations is aromatic residues in the active site of the enzymes, and are amino acids that has an effect on the enzyme processivity. Several studies have shown that the processivity may come at the expense of the enzyme speed and efficiency, and that less processive enzymes could be more efficient on substrates with a less crystalline structure. The activity-assays purpose is to investigate if the mutants that has lost aromatic residues, which are of importance to its processive qualities, can be just as efficient or even more efficient than the wildtype enzyme on the substrate pretreated with CBP21. The results showed an increase in activity on the pretreated substrate compared to the untreated substrate, and the increase was higher for the mutants than for the wildtype enzymes. The effect was also in general higher with ChiB, than ChiA. The mutant ChiB-W220A was in fact faster than ChiB-WT.