Termodynamiske signaturer for substratbinding til cellulaser fra Thermobifida fusca

Abstract

Denne oppgaven er skrevet som en del av et større forskningsprosjekt der det overordnede målet er å tilegne seg kunnskap om enzymer som katalyserer hydrolyse av de krystallinske substratene cellulose og kitin. Cellulose er den vanligste biopolymeren i naturen og består av β (14) linkede ᴅ-glukoseenheter. Thermobifida fusca er en filamentøs jordbakterie og en viktig nedbryter av organisk materiale. T.fusca syntetiserer en rekke ekstracellulære cellulaser som katalyserer nedbrytning av cellulose, hvorav tre er undersøkt nærmere i denne oppgaven. TfCel5A er en ikke-prosessiv endoaktiv cellulase, TfCel9A er prosessiv og endoaktiv og TfCel48A er prosessiv og eksoaktiv fra den reduserende enden. De termodynamiske signaturene for binding av (Glc)6 til inaktive mutanter av TfCel5A, TfCel9A og TfCel48A har blitt bestemt ved hjelp av isoterm titreringskalorimetri (ITC). Ved 30 °C og pH 6,0 er endringen i bindingsfrienergi lik for de prosessive cellulasene TfCel9A og TfCel48A (hhv. ΔGr° = −8,7 kcal/mol ± 0,2 / −8,6 ± 0,2 kcal/mol). For TfCel5A er endringen i bindingsfrienergi mindre gunstig (ΔGr° = −6,4 ± 0,1 kcal/mol). I TfCel9A og TfCel48A er bindingen drevet av gunstig endring i både entalpi (ΔHr° = −1,1 ±0,1 kcal/mol for TfCel9A og ΔHr° = −2,7 ± 0,3 kcal/mol for TfCel48A) og entropi (−TΔSr° = −7,6 ± 0,2 kcal/mol for TfCel9A og −TΔSr° = −5,9 ± 0,4 kcal/mol for TfCel48A). Binding av (Glc)6 til TfCel5A er kun entalpisk drevet ved 30 °C (ΔHr° = − 6,4 ± 0,2 kcal/mol, −TΔSr° = 0,0 ± 0,2 kcal/mol). Endringen i varmekapasitet, ΔCp,r°, er 209 ±17 cal/K·mol, 239 ± 21 cal/K·mol og 176 ± 25 cal/K·mol for henholdsvis TfCel5A, TfCel9A og TfCel48A. Det foreligger en hypotese som direkte kobler bindingsfrienergi (ΔGr°) og iboende prosessivitet (PIntr). De eksperimentelt bestemte ΔGr° fra denne oppgaven har derfor blitt sammenlignet med tidligere publiserte prosessivitetsverdier for TfCel5A, TfCel9A og TfCel48A. Resultatene indikerer at det er en kvalitativ sammenheng mellom bindingsfrienergi og prosessivitet. I tillegg til ITC-forsøk har det blitt utført hydrolyse av cello-oligosakkarider ((Glc)x) i H218O med aktive enzymer, for å undersøke posisjoneringen av substratet i det aktive setet. Resultatene fra hydrolyse av (Glc)5 i H218O viser at binding i subsete −3  +2 dominerer i TfCel48A, med en dimer i de to produktbindende subsetene +1 og +2. Den endoaktive TfCel5A hadde samme posisjonering av substratet. I TfCel9A dominerer binding −4  +1 ved hydrolyse av (Glc)5, der de negative subsetene (−4 til −1) antas å være produktbindende.

This thesis was written as part of a larger research project were the objective is to acquire knowledge about enzymes involved in the breakdown of recalcitrant polysaccharides such as cellulose and chitin. Cellulose is the most abundant biopolymer in nature and is composed of β (14) linked ᴅ- glucose units. The smallest structural unit is a dimer, cellobiose. Thermobifida fusca is a filamentous soil bacterium and a major degrader of organic material. It produces several extracellular cellulases and three of them have been studied in this thesis. TfCel5A is a non-processive and endo-acting cellulase, TfCel9A is processive and endo-acting and TfCel48A is a reducing end-specific processive exo-acting cellulase. The thermodynamic signatures for binding of (Glc)6 to inactive mutants of TfCel5A, TfCel9A and TfCel48A was determined by isotherm titration calorimetry (ITC). The processive cellulases TfCel9A and TfCel48A bind the substrate with similar affinity at 30 °C and pH 6,0 ( ΔGr° = −8,7 kcal/mol ± 0,2 and −8,6 ± 0,2 kcal/mol, respectively). TfCel5A has a slightly lower binding affinity (ΔGr° = −6,4 ± 0,1 kcal/mol). The binding in TfCel9A and TfCel48A is accompanied by a favorable change in both enthalpy (ΔHr° = −1,1 ±0,1 kcal/mol for TfCel9A and ΔHr° = −2,7 ± 0,3 kcal/mol for TfCel48A) and entropy (−TΔSr° = −7,6 ± 0,2 kcal/mol for TfCel9A og −TΔSr° = −5,9 ± 0,4 kcal/mol for TfCel48A). The binding of (Glc)6 in TfCel5A is driven only by the favorable change in enthalpy (ΔHr° = − 6,4 ± 0,2 kcal/mol, −TΔSr° = 0,0 ± 0,2 kcal/mol). The change in heat capacity, ΔCp,r°, is 209 ±17 cal/K·mol, 239 ± 21 cal/K·mol og 176 ± 25 cal/K·mol for TfCel5A, TfCel9A og TfCel48A respectively. A mathematical relationship that directly links binding free energy (ΔGr°) with intrinsic processivity (PIntr) has been proposed. On this basis, the experimental ΔGr° from this thesis was compared to previously published processivity values for TfCel5A, TfCel9A and TfCel48A. The results indicate a qualitative relationship between binding free energy and intrinsic processivity. In addition to the ITC experiments, hydrolysis of cello-oligosaccharides was performed to study positioning of the substrate in the active site. The results from hydrolysis of (Glc)5 in H218O show binding in subsite −3  +2 dominating in TfCel48A, with a dimer in the two product binding subsites +1 and +2. The same positioning of the substrate is observed with the endo-acting TfCel5A. The preferred binding of (Glc)5 in TfCel9A is in subsites −4  +1. These negative subsites (−4 to −1) are probably product binding.