Transglykosylerings aktivitet hos to familie 18 kitinaser, ChiA og ChiB fra Serratia marcescens

Abstract

Denne masteroppgaven er skrevet som del av et større forskningsprosjekt hvor hovedmålet er å studere og utvikle enzymer som effektivt degraderer kitin og dets vannløselige derivat kitosan, til kitooligosakkarider med en bestemte lengde og en gitt grad av acetylerte enheter. Dette kan oppnås ved enzymatisk hydrolyse eller ved å bruke transglykosylerende enzymer. Kitin er et lineært uløselig polysakkarid som består av repeterte N-acetyl-Dglukosaminenheter (GlcNAc eller A) som er rotert 180 grader i forhold til hverandre og er bundet sammen av β 1,4- glykosidbindinger. Kitinaser, glykosyl hydrolaser i familie 18 og 19, katalyserer hydrolyse av kitin og har vist transglykosylerende egneskaper. I denne oppgaven var hovedmålet å lage og studere ulike seterettetde muterte enzymer for å undersøke endringer i transglykosylerings aktiviteten. I tillegg ble det forsøkt å forbedre proteinuttrykket for kitinasene. Mutantene ChiB R294A, ChiB Y214F, ChiA F396W og ChiA D313N/F396W ble benyttet. I tillegg ble mutanten ChiB D142N tillaget ved hjelp av seteretet mutagenese, som et templat for ChiB D142N/R294A og ChiBD142N/Y214F, men grunn av feil i DNA sekvensen til templatet ble ikke disse mutasjonene vellykket. ChiA og ChiB villtype ble klonet inn i en pET-16b vektor fra en pMay2-10 vektor som gav en ≈105 gangers økt proteinmengde for ChiB og en ≈3 gangers økt proteinmengde for ChiA i forhold til tidligere protokoller. Det ble gjennomført et transglykosylerings assay med de ulike mutantene som ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF MS og HPLC. Analyse av HPLC resultatene viste at ChiA D313N/F396W har høyest transglykosyleringsaktivitet av tilgjengelige mutanter. ChiA F396W viste også høye verdier, mens ChiB R294A og Y214F viste en noe lavere aktivitet. MALDITOF spekterene viste at alt substratet ble nedbrutt til (GlcNAc)2, bortsett fra for ChiA D313N/F396W hvor (GlcNAc)3, (GlcNAc)4 og (GlcNAc)6 ble detektert. For videre forsøk bør tidspunkt for prøveuttak endres. Et nedbrytningsforsøk med (GlcNAc)6 og ChiB Y214F viste at substrat binding i subsetene -2 til +4 og -3 til +3 var i samsvar med ChiB villtype. Dette viser at mutasjonen ikke endrer substratposisjoneringen. This thesis is written as part of a larger research project whose main goal is to study and develop enzymes thatre efficiently degrade chitin and its water-soluble chitosan derivative, to chitooligosaccharides with a certain length and a given degree of acetylated units. This can be achieved by enzymatic hydrolysis or transglycosylation. Chitin is a linear insoluble polysaccharide composed of repeating N-acetyl-D-glucosamine units (GlcNAc or A) which is rotated by 180 degrees relative to each other and are bonded together by β 1,4 - glycosidic bonds. Chitinase, glycosyl hydrolases family 18 and 19 catalyze the hydrolysis of chitin and have shown transglycosylation activity. In this thesis, the main objective was to create and study various site-directed mutant enzymes, to examine changes in transglycosylation activity. In addition, attempts were made to improve protein expression of chitinase. The mutants ChiB R294A, ChiB Y214F, ChiA F396W and ChiA D313N/F396W were used. In addition, the mutant ChiB D142N was prepared to be used as a template for ChiB D142N/R294A and ChiBD142N/Y214F. Because of errors in the DNA sequence of the template, these two mutations were not successful. ChiA and ChiB wild type was cloned into a pET-16b vector from a pMay2-10 vector, resulting in a ≈ 105-fold increase in protein quantity ChiB and ≈ 3-fold increased protein amount of ChiA compared to previous protocols. It was conducted a transglycosylation assay were the different mutants were analyzed by MALDI-TOF MS and HPLC. Analysis of HPLC results showed that ChiA D313N/F396W had the highest transglycosylation activity of available mutants. ChiA F396W also showed high values, while ChiB R294A and Y214F showed a slightly lower activity. MALDI-TOF spectra showed that all the substrate was hydrolysed to (GlcNAc)2, except ChiA D313N/F396W where (GlcNAc)3 (GlcNAc)4 and (GlcNAc)6 was detected. For further research time of sampling should be the changed. A hydrolyzing experiment of (GlcNAc)6 and ChiB Y214F showed that substrate binds to the subsets of -2 to +4 and -3 to 3 similarly as ChiB wild type. This shows that the mutation do not change the substrate positioning.