| dc.description.abstract | Denne oppgaven er skrevet som en del av et større forskningsprosjekt der det overordnede målet er å tilegne seg kunnskap om enzymer som katalyserer hydrolyse av den uløselige polymeren kitin. Kitin er en lineær β-1,4-bundet polymer av N-acetyl-D-glukosamin og er den nest vanligste biopolymeren i naturen, etter cellulose. Det kitinolytiske maskineriet til den gram-negative jordbakterien Serratia marcescens består av tre kitinaser: kitinase A (ChiA), kitinase B (ChiB) og kitinase C (ChiC). ChiA og ChiB er begge prosessive eksoenzymer som katalyserer hydrolyse av kitin fra henholdsvis reduserende- og ikke-reduserende ende. ChiC er et ikke-prosessivt endoaktivt enzym.
I denne oppgaven har de termodynamiske signaturene for binding av (GlcNAc)6 til inaktive mutanter av ChiA og ChiC blitt bestemt ved hjelp av isoterm titreringskalorimetri (ITC) og sammenlignet med tilsvarende signaturer for ChiB. Ved 30 °C og pH 6,0 er bindingsfrienergiendringen tilnærmet lik for alle kitinasene. Bindingsreaksjonen er entalpisk drevet i ChiC (ΔH°r = -7,8 ± 0,2 kcal/mol, -TΔS°r = -1,9 ± 0,2 kcal/mol), entropisk drevet i ChiB (ΔH°r = -0,1 ± 0,3 kcal/mol, -TΔS°r = -9,2 ± 0,3 kcal/mol), og drevet med omtrent like store bidrag entalpisk og entropisk i ChiA (ΔH°r = -4,5 ± 0,2 kcal/mol, -TΔS°r = -4,2 ± 0,2 kcal/mol). Endring i solvatiseringsentropien er mest gunstig for ChiA (-TΔS°solv = -17,5 ± 1,0 kcal/mol), mens den er lik for ChiB og ChiC (-TΔS°solv = -11,5 kcal/mol). Ved sammenligning av binding til (GlcNAc)6 og allosamidin viser resultatene at ChiA blir mest desolvatisert i positive subseter, at ChiC blir mest desolvatisert i negative subseter, mens det er en relativt lik fordeling for ChiB. Videre er endring i konformasjonsentropien ugunstig for ChiA og ChiC (-TΔS°conf = 10,9 ± 1,0 kcal/mol for ChiA og 7,2 ± 1,0 kcal/mol for ChiC), mens den er nøytral for ChiB (-TΔS°conf = -0,1 ± 0,6 kcal/mol). Binding til (GlcNAc)6 fører generelt til en mer ugunstig endring i konformasjonsentropien sammenlignet med binding til allosamidin. Dette er mest sannsynlig et resultat av redusert fleksibilitet hos både protein og ligand ved kompleksdannelse.
Videre har bindingen av (GlcNAc)6 til ChiA-W167A, ChiA-W275A og ChiA-F396A blitt studert med ITC ved 30 °C og pH 6,0. Resultatene viser at det residuet som er viktigst for prosessivitet, Trp167, også er det residuet som binder sterkest til substratet (Kd = 134 ± 0,03 µM, ΔGr° = −5,4 ± 0,1 kcal/mol for ChiA-W167A). I motsetning bidrar residu i produkt dissosiasjonssubseter, Trp275 og Phe396, i mindre grad til bindingen av substratet (Kd = 2,1 ± 0,3 µM, ΔGr° = −7,9 ± 0,1 kcal/mol for ChiA-W275A og Kd = 1,2 ± 0,1 µM, ΔGr° = −8,2 ± 0,1 kcal/mol for ChiA-F396A). | nb_NO |
