Stammespesifikk karakterisering av mikrobiota hos mødre og barn

Abstract

En identifikasjon på art og stammenivå vil kunne gi utfyllende taksonomisk informasjonen utover den som allerede eksisterer basert på 16S rRNA genet. Denne informasjonen kan brukes til å gi et dypere innblikk i den bakterielle diversiteten i uliker mikrobiotaer hos mennesket. Spesielt vil dette gjelde i forhold til overføring av bakterier. Målet med denne masteroppgaven var derfor å kunne utvikle en stammespesifikk PCR som skulle gjøre det mulig å differensiere ulike bakteriestammer fra hverandre ved bruk av Illuminasekvensering. Denne metoden ble deretter brukt til å undersøke om bakteriell overføring mellom mor og barn kunne bekreftes. Vi evaluerte området mellom 16S-23S (ITS) rRNA genet og tmRNA genet som mulig kandidat for stammespesifikk identifisering. ITS primer paret ga et noe mer stabilt resultat ved amplifikasjon enn tmRNA primerparet, og ble valgt til videre evaluering av en stammespesifikk Illuminasekvensering. Evalueringen innbefattet test av et referansesett med tarmbakterier. Denne testingen viset at metoden hadde god sensitivitet og spesifisitet. For undersøkelse av bakteriell overføring fra mor til barn benyttet vi DNA i fra avføring og morsmelk, med opphav fra mor- barnpar som deltok i pro-PACT studiet. Parene som deltok i pro-PACT studie var delt inn i to ulike grupper, avhengig om mødrene hadde drukket Biola eller placebo melk fra svangerskaps uke 36 til tre måneder etter fødselen under amming. Morsmelk- og avføringsprøvene ble amplifisert med ITS primer paret, og amplikonene ble sekvensert med Illuminateknologien. Resultatene viste at ved å benytte det universelle ITS primerparet var det mulig å identifisere bakterier helt ned på stammenivå, og overføring mellom mor og barn kunne bekreftes. Sekvenseringen avdekket at 8 av de 10 mest dominante OTU’ene observert i morsmelk og avføringsprøvene analysert fra 19 mor- barnpar, var adressert til slekten Streptococcus. Den mest dominerende OTU’en totalt representerte en streptokokk som opprinnelig hadde blitt isolert fra munnhulen hos menneske. Disse streptokokkene ble funnet igjen i morsmelken til alle mødrene og var ofte, men ikke alltid, stabil over tid innenfor et individ. Utviklingen av metoden befinner seg i en tidlig startfase. Denne studien viser at den innehar et potensialle som gjør det mulig å påvise bakterier på stammenivå, som kan utnyttes ved karakterisering av ulike bakterielle økosystemer.