Hemming og frigjøring av biofilm for Staphylococcus spp. : med vekt på produksjonsmiljø for mat

Abstract

Stafylokokker kan danne biofilm, og det er antatt at biofilmdannelse spiller en viktig rolle for overlevelse av bakterien i næringsmiddelindustrien. Kunnskap om sammensetning av biofilm matriks er nyttig med tanke på metoder for fjerning. Det har etter hvert blitt stort fokus på bakterienes egen evne til å løse opp biofilm, da det antas at disse mekanismene kan benyttes til målrettet bekjempelse av biofilm. Hensikten med denne masteroppgaven var å finne ut om ulike kjemiske forbindelser (D-aminosyrer, norspermidin og enzymer) kan hemme biofilmdannelse hos stafylokokker. Det ble også undersøkt om bakterien selv danner forbindelser som løser opp biofilm. Biofilm ble dyrket i mikrotiterplater i et glukose- og NaCl-beriket vekstmedium, med tilsatt enzymer/D-aminosyrer/norspermidin, i to dager ved 30 °C. Platene ble deretter vasket, - og farget med krystallfiolett. Farge ble utløst med surgjort etanol. Absorbans (OD600) av utløst farge, ble et mål på biofilmdannelse hos hver enkelt stamme. Ved undersøkelse om Staphylococcus danner forbindelser som løser opp egen biofilm, ble stammene inkubert i 14 dager i reagensrør ved 30 °C og 150 rpm. Biofilmdannelse ble målt ved farging (som for mikrotitermetode) og absorbans, i tillegg til visuell observasjon. Supernatant fra stammer med nedgang i biofilmdannelse ble deretter testet på et utvalg stammer for å se om den hadde en dispergerende effekt på biofilm. Det ble vist at de ulike stammene av Staphylococcus i dette forsøket, hadde ulik respons ved tilsetning av forskjellige enzymer. Enkelte stammer av S. cohnii fikk hemming i biofilmdannelse i nærvær av proteaser. Dette indikerer en biofilm hvor proteiner utgjør en stor del. Biofilm hos enkelte stammer av S. aureus og S. epidermidis ble hemmet av Dispersin B og DNAse, dette indikerer en biofilm sammensatt av store deler ekstracellulært DNA og polysakkarider (PIA). Det ble det vist at S. cohnii (MF 1844) og S. epidermidis (MF 2601) hadde nedgang i biofilmdannelse etter inkubering i 14 dager. Begge stammene hadde supernatant som ga signifikant hemming i biofilmdannelse på seg selv og hverandre. Det ble vist at S. cohnii (MF 1844) dannet supernatant som ikke lot seg inaktivere ved varmebehandling (85 °C i 20 min). Dette indikerer at bakterien danner biofilmhemmende varmestabile komponenter. I dette arbeidet ble det vist lite hemmende effekt av D-aminosyrer og norspermidin på utvalget av Staphylococcus. Ulike stammers respons på enzymer, samt dannelse av komponenter som løser opp biofilm, er kunnskap som kan være nyttig i utarbeidelse av bedre metoder for bekjempelse av biofilm i næringsmiddelindustrien.

Staphylococci have the ability to form biofilms. It is assumed that biofilm formation plays an important role for survival of these bacteria in the food industry. It is increasingly focused on the bacteria's own ability to dissolve biofilm, as it is believed that these mechanisms can be used for targeted control of biofilms. The purpose of this thesis was to investigate whether various chemical compounds (enzymes, D-amino acids and norspermidine), can inhibit biofilm formation of different strains/species of Staphylococcus. It was also investigated whether Staphylococcus form compounds that dissolves biofilm. Biofilms were grown in microtiter plates with glucose-and NaCl-enriched growth medium, added enzymes/D-amino acid/norspermidine, for two days at 30 ° C. The plates were then washed and stained with crystal violet. Color was dissolved with acidified ethanol. Absorbance (OD600) of dissolved color was a measure of biofilm formation of each strain. Upon investigation whether Staphylococcus form substances that solves their own biofilms, the strains were incubated for 14 days in test tubes at 30 ° C and 150 rpm. Biofilm formation was measured by staining (as microtiter method) and absorbance, in addition to visual observation. Supernatant from strains with decrease in biofilm formation, were then tested on a sample of strains to investigate if the supernatant inhibited biofilm formation. It was shown that biofilm formation of the Staphylococcus strains in this experiment was effected by the addition of various enzymes. Certain strains of S. cohnii had an inhibition of biofilm formation in the presence of proteases. This indicates a biofilm where proteins constitute a large part. Biofilm in some strains of S. aureus and S. epidermidis was inhibited by Dispersin B and DNAse, indicating a biofilm composed of large parts of extracellular DNA and polysaccharides (PIA). S. cohnii (MF 1844) and S. epidermidis (MF 2601) had a decrease in biofilm formation after incubation for 14 days. Both bacteria’s produced components in their supernatants which gave significant inhibition of biofilm formation when tested on themselves and each other. S. cohnii (MF 1844) formed a supernatant that did not seem to be inactivated by heat treatment (85 ° C for 20 min). This indicates that the bacteria formed heat stable biofilm inhibiting components. In this work it was demonstrated little inhibitory effect of D-amino acids and norspermidine on the selection of staphylococci. The response to various enzymes by different strains of staphylococci, and formation of components that dissolve biofilm, is knowledge that can be useful in the improvement of methods for control of biofilms in the food processing industry.