| dc.description.abstract | Denne oppgaven er skrevet som en del av et større forskningsprosjekt hvor det overordnede målet er å utvikle enzymer som mest mulig effektivt degraderer den uløselige biopolymeren kitin, og dets vannløselige analoge kitosan (delvis deacetylert kitin) til oligosakkarider av en gitt lengde. Aromatiske residuer har blitt studert i tidligere studier, og har vist seg å være viktige for både enzymets prosessivitet og substrat posisjonering. I denne oppgaven var målet å studere sterkt interagerende polare residuer i det aktive setet i kitinase A, og hvilken effekt disse har for enzymets prosessivitet og substrat posisjonering.
Kitin er et uløselig lineært homopolysakkarid som består av repeterte β -(1-4)-koblede N-acetyl-D glukosamine enheter (GlcNAc eller A), og er en vanlig bestanddel i eksoskjellettet hos leddyr, insekter, krepsdyr, og en fundamental komponent i celleveggen i sopp.
I den første delen av oppgaven, ble kitinase A mutanter laget ved seteretettet mutagenese. Tre aktive og tre inaktive mutanter ble laget; R172A, E473A, T276A, E315Q/R172A, E315Q/E473A og E315Q/T276A. Mutantente ble isolert, renset og tilslutt ble DNA-konsentrasjonene målt.
I den andre delen av oppgaven ble kitosan med en acetyleringsgrad lik 0,65 brukt til å studere de aktive mutantene sin aktivitet mot det løselige substratet. Dette ble gjort gjennom 1H NMR spektroskopi og størrelses eksklusjonskromatografi. Videre ble MALDI-TOF-TOF MS/MS brukt til å studere subsetepreferanser (acetylert eller deacetylert) av derivatiserte kitooligosakkarider. R172A viste absolutt preferanse for en acetylert enhet i subsete -1, mens ingen andre klare preferanser ble identifisert. T276A viste sterk preferanse for en acetylert enhet i subsete -1, -3 og -4. Det var ingen klare preferanser for acetylert eller deacetylert enhet i subsete -2. Kitinase A villtype fra tidligere studier viser sterk preferanse for en acetylert enhet i subsete -4 og -2, og en absolutt preferanse for en acetylert enhet i subsete -1.
I den tredje delen av oppgaven ble nedbrytning av β-kitin studert ved hjelp av “High pressure Liquid Chromatography”. Forholdet mellom dimer og monomer ble bestemt, og kan gi informasjon om enzymets prosessive mekansime. Mutasjon av R i posisjon 172 og E i posisjon 473 påvirket ikke enzymets prosessive aktivitet mot β kitin i stor grad ved sammenlikning med kitinase A villtype. T i posisjon 276 reduserte enzymets prosessive aktivitet ved sammenlikning med kitinase A villtype.
Resultatene indikerer at noen polare aminosyrer i det aktive setet er viktige for enzymets prosessive mekanisme, mens andre er viktige for posisjonering av substratet i det aktive setet.
| no_NO |
