A study on the effects of aminoacids and arginine deiminase (arcA) on growth, metabolism and gene expression in Enterococcus faecalis V583

Abstract

In this study the roles of amino acids and arginine deiminase (arcA) in Enterococcus faecalis V583‟s growth, metabolism and gene expression were investigated. Literature describes only one pathway of arginine catabolism for Enterococcus faecalis V583 in the ADI-pathway where arginine deiminase catalyzes the deamination of L-arginine, producing L-citrulline and ammonia. A deletion of arcA was constructed in Enterococcus faecalis V583 (ΔarcA), but surprisingly L-arginine was still broken down in a glucose-limited continuous culture, suggesting an alternative arginine deiminase or alternative pathway for arginine catabolism exists in the E. faecalis V583 genome. A significant effect of the arcA deletion was observed on growth and metabolism both in batch culture with no nutritional limitation, and in glucoselimited continuous culture. Growth studies in batch culture using a defined medium with amino acid leave-out compositions showed that amino acid availability played a significant role in both E. faecalis V583 wild type and mutant growth. A significant reduction in growth rate and a more pronounced death phase was observed for the ΔarcA mutant in comparison to wild type. Growth in glucose-limited continuous culture revealed a pH-dependency on the shift between homolactic and mixed acid fermentation. Transcriptional analysis by real-time PCR also showed pH-dependency of pflA transcription, revealing a down-regulation of pflA in pH 6.5 culture compared to pH 7.5 culture. A reduction in free phosphate concentrations in the mutant cultures, together with provisional genomic data of a polyphosphate kinase (ppnK) gene at EF2670 indicates E. faecalis V583 might be able to produce polyphosphates in stressful environments. A significant reduction in biomass for the ΔarcA mutant in comparison to wild type also suggests a less efficient metabolism for the ΔarcA mutant. Complementation of the E. faecalis V583ΔarcA mutant was performed, providing an intact arcA gene in trans, and construction of a double deletion mutant E. faecalis V583ΔglnAΔarcA was also performed. A preliminary growth study in batch culture showed no growth difference between E. faecalis V583ΔarcA and the complemented E. faecalis V583ΔarcA, suggesting that providing an intact arcA gene is not sufficient to restore ADI-pathway function. A significant difference between E. faecalis V583ΔglnA and V583ΔglnAΔarcA was observed, with V583ΔglnAΔarcA growing significantly slower, but reaching a higher OD600 before initiating stationary phase. I dette arbeidet har effekten av ulike aminosyrer og arginine deiminase (arcA) på vekst, metabolisme og genekspresjon i Enterococcus faecalis V583 blitt undersøkt. Kun en vei for nedbrytning av L-arginine har så langt blitt beskrevet for E. faecalis V583. Her deamineres Larginine i en reaksjon katalysert av arginine deiminase, og L-citrulline og ammoniakk blir dannet. En mutant med delesjon av arcA (ΔarcA) ble konstruert i E. faecalis V583. Data fra glukose-begrenset kontinuerlig kultur viste imidlertid at L- arginine fortsatt ble brutt ned i mutanten, noe som indikerer at en alternativ arginine deiminase, eller en alternativ katabolsk vei eksisterer for E. faecalis V583. En signifikant effekt av arcA delesjonen på vekst og metabolisme ble observert i kultur både med og uten glukose-begrensning. Vekstforsøk i batchkulturer i et definert medium, der enkelte aminosyrer ble utelatt, viste at tilgjengeligheten av aminosyrer har en signifikant rolle i veksten til både ΔarcA mutanten og villtypen av E. faecalis V583. Videre ble en signifikant reduksjon av veksthastigheten og en mer utpreget dødsfase observert hos ΔarcA mutanten sammenlignet med villtypen. Vekst i glukose-begrenset kontinuerlig kultur viste et pH-avhengig skifte mellom homolaktisk og blandet syrefermentering. Transkripsjonsanalyser, gjort med sanntids-PCR, viste også en effekt av pH på transkripsjonsnivå av pflA, med en nedregulering av pflA i pH 6.5 kulturen kontra pH 7.5 kulturen. En reduksjon i mengden fritt fosfat i mutanten, sammen med et gen med homologi til polyfosfat kinase (ppnK) i EF2670, foreslår at E. faecalis V583 kan være i stand til å danne polyfosfater under stress. En signifikant reduksjon av biomassen for ΔarcA mutanten, i forhold til villtypen, indikerer en mindre effektiv metabolisme hos mutanten kontra villtypen. Komplementering av ΔarcA mutanten der et intakt arcAble tilført in trans, ,og konstruksjon av en dobbel delesjonsmutant E. faecalis V583ΔglnAΔarcA ble gjort. Et innledende vekstforsøki batchkultur viste ingen forskjellig mellom E. faecalis V583ΔarcA og E. faecalis V583ΔarcA komplementert. Denne observasjonen indikerer at et intakt arcA gen ikke er tilstrekkelig for å gjenopprette arginine deiminase-funksjonen i cellen. En signifikant forskjell av vekst mellom E. faecalis V583ΔglnA and V583ΔglnAΔarcA ble også observert. V583ΔglnAΔarcA viste en signifikant reduksjon i veksthastighet, men vokser til en signifikant høyere OD600 før stasjonærfase innledes.