| dc.description.abstract | Dette studiet er en del av et større prosjekt hvor det langsiktige målet er å utvikle orale vaksiner basert på lactobacilli, for eksempel vaksiner mot kreft eller tuberkulose. Lactobacilli er interessante kandidater til bruk ved oral vaksinering fordi de har GRAS-status (”Generally Regarded As Safe”), tåler sure væsker som magesyre og har vist høy overlevelsesevne i fordøyelseskanalen. I tillegg til dette er flere Lactobacillus- stammer blitt sekvensert i den senere tid, og er derfor lett tilgengelig for genetisk modifisering. Det har tidligere blitt utviklet flere induserbare system for effektiv intracellulær protein produksjon, som har blitt videre utviklet til å produsere proteiner som fraktes ut av cellen og eventuelt feste seg kovalent til overflaten på bakterien.
I dette studiet var målet å vurdere forskjellige Lactobacillus arter med hensyn til deres evne til og produsere og sekretere et heterologt protein, NucA. Studiet tok utgangspunkt i såkalte pSIP vektorer utviklet til bruk i L. plantarum og L. sakei og signal peptider selektert fra L. plantarum. I de tidligere studiene hadde man vist at disse vektorene ga sekresjon men ofte med lav produksjonsnivå og sekresjonseffektivitet. Tre pSIP-vektorer med ulike signal peptider (SP’er) ble valgt ut ifra et tidligere konstruert signal peptid-bibliotek med SP’er fra L. plantarum, og vektorene ble modifisert ved å bytte replikon fra det smalspektret vert-spesifikke replikonet fra L. plantarum, r256, til det mer bredspektret replikonet fra L. lactis, SH71. De nykonstruerte vektorene ble så transformert inn i fem ulike arter av Lactobacillus, L. plantarum, L. curvatus, L. brevis, L. gasseri og L. rhamnosus. Resultatene viste betydelig variasjon mellom artene, men viste også at gode sekresjonsnivå kunne blitt oppnådd i fire av fem, avhengig av hvilket SP som ble benyttet. Det var kun for L. rhamnosus at ikke samme nivå, som tidligere sett for L. plantarum, ble oppnådd. Sekresjonseffektivitetene ble testet for en del av transformantene og den var generelt høy; forskjellene i sekresjonsnivåene så ut til og primært være et resultat av variasjon i produksjonsnivået, en variasjon som er vanskelig å forklare. Resultatene viser at SP’er fra L. plantarum WCFS1 har god tilpasning til komponenter i sekresjonsmaskineriet i andre lactobacilli og kan dirigere effektiv sekresjon i disse. Det er imidlertid en del variasjon; for eksempel så fungerte SP_2578 (SP fra Lp_2578 proteinet) i L. curvatus og L. brevis på tross av at det fungerte relativt dårlig i L. plantarum og L.rhamnosus. SP fra LP_3050 proteinet var det SP’et som jevnt over resulterte i best sekresjon i samtlige av de høyt produserende artene.
Resultatene viser at lactobacilli generelt fungerer godt med det induserbare pSIP-systemet for genuttrykk og med signalpeptidet fra L. plantarum. Dette tyder på at de fleste av de testede stammene mest sannsynlig er godt egnet til in situ produksjon og levering av terapeutiske proteiner i mennesker på lik linje med L. plantarum. For L. plantarum selv, viste dette studiet en betydelig økning i produksjon av NucA etter replikonbyttet fra r256 (L. plantarum) til SH71 (L. lactis), mest sannsynlig grunnet et høyere plasmid kopinummer ved bruk av SH71 replikonet. Dette styrker L. plantarum som
potensiell kandidat for leverandør av vaksiner da det er sannsynlig at bruk av SH71 replikonet også vil bedre produksjonen av et terapeutisk protein. Det er lovende at flere lactobacilli ser ut til å kunne brukes da forskjellige arter kan influere det humane immunsystem på ulike måter, og muligheten til å bruke disse bidrar derfor til å utvide verktøykassen for utvikling av levende vektorer i matbaserte produkter. This study is part of a larger project in which the long-term goal is to develop oral vaccines based on lactobacilli, such as vaccines against cancer or tuberculosis. Lactobacilli are interesting candidates for use in oral vaccination because they have GRAS status ("Generally Regarded As Safe"), because they can tolerate acidic fluids such as gastric acid, and because they have shown high survival in the digestive tract. In addition, the genomes of several Lactobacillus strains have recently been sequenced, making these bacteria more accessible to manipulation. Several inducible systems for effective intracellular protein production have been developed for lactobacilli, including systems for producing proteins that are transported out of the cell, and/or attached covalently to the surface of the bacteria. In this study the aim was to evaluate different Lactobacillus species with respect to their ability to produce and secrete a heterologous reporter protein, NucA. The study was based on the so-called pSIP vectors, designed for use in L. plantarum and L. sakei, and signal peptides selected from L. plantarum. Previous studies had shown that these vectors yield secretion, but often with low production levels and low secretion efficiencies. Three pSIP vectors with different signal peptides (SP’s) were selected from a previously designed SP-library with SP's from L. plantarum, and the vectors were modified by replacing their narrow-host-range L. plantarum replicon from plasmid p256, by broad-host-range, high copy number replicon from L. lactis plasmid pSH71. The newly constructed vectors were transformed to five different species of Lactobacillus: L. plantarum, L. curvatus, L. brevis, L. gasseri and L. rhamnosus. The results revealed considerable variation between species, but also showed that high secretion levels could have been achieved in four out of five species depending on the SP used. Only one of the species, L. rhamnosus, did not yield the same levels of secreted protein as previously found in L. plantarum. Secretion efficiencies were tested for a number of transformants and were generally high. Thus, the differences in secretion levels were primarily a result of variation in production levels, which is difficult to explain. The results show that SP's from L. plantarum WCFS1 are well adapted to components of the secretion system in other lactobacilli and can therefore direct efficient secretion in other species. However, some variation was observed; for instance, the SP_2578 (SP from Lp_2578 protein) functions well in L. curvatus and L. brevis in spite of the fact that it functioned relatively poorly in L. plantarum and L. rhamnosus. The SP from the Lp_3050 protein generally resulted in better secretion in all of the well-producing species. The results show that lactobacilli generally function well with the inducible pSIP expression system, using signal peptides from L. plantarum. This suggests that most of the tested strains most likely are suitable for in situ production and delivery of therapeutic proteins in humans on an equal footing with L. plantarum. For L. plantarum this study showed a significant increase in the production of NucA by exchanging the r256 replicon (L. plantarum) with the SH71 replicon (L. lactis), most likely due to a
higher plasmid copy number obtained with the SH71 replicon (as verified by qPCR). This strengthens L. plantarum as a supplier of vaccines as it is likely that use of the SH71 replicon also will improve the production of a therapeutic protein. It is promising that several other lactobacilli also may be used. Different species can influence the human immune system in different ways, and the ability to use these species helps to expand the toolbox for the development of live vectors for vaccine delivery in food-based products. | no_NO |
