Characterization and engineering of the thermo-stability of the chitin binding protein CBP21 from Serratia marcescens

Abstract

Denne masteroppgaven beskriver funksjonen og stabiliteten til CBM33 proteiner. Tidligere ble disse proteinene definert som ”Karbohydrat Bindende moduler” eller “Carbohydrate-Binding Modules”, men disse modulene har vist seg også å ha en enzymatisk funksjon som oksidere og hydrolysere polysakkarider. Noen av CBM33 modulene bryter ned chitin (Vaaje-Kolstad et al., 2005a,b, 2010), mens andre bryter ned cellulose(Forsberg et al., 2011). CBM33 proteinene samarbeider synergistisk med klassiske hydrolaser (for eksempel chitinaser eller cellulaser) og deres bidrag kan øke den enzymatiske nedbrytningsprosessen. Disse enzymene er av stor forskningsmessig og kommersiell interesse, siden de kan utnyttes til å gi en mer effektiv omdanning av uløselig biomasse. I denne oppgaven har vi studert CBM33 proteinene CBP21 fra jordbakterien Serratia marcescenc og EfCBM33 produsert av Enterococcus faecalis, en opportunistisk bakterie fra tarmfloraen som ofte blir sett i sammenheng med sykehusinfeksjoner. CBP 21 er med på å bryte ned det uløselige polysakkaridet β-kitin som er en av de mest utbredte polymerene i verden. I denne oppgaven har vi først forsøkt å utvikle en ny metode for å se hvor effektivt CBP21 kan binde β-kitinet. Målet var å utvikle en mer effektiv analysering av bindingen, ved å overvåke fluorescens signalet over tid mens CBP21 bandt til β-kitinet. Deretter var tanken å bruke denne analysemetoden for å se om enzymet kunne binde mer effektivt ved tilsetning av forbindelser som metaller og reduktanter. Dessverre fungerte ikke denne metoden som planlagt da signalene var meget ustabile og heller ikke reproduserbare, mens kontrollreaksjonene (dvs. med enzym men uten substrat) viste en tilsvarende nedgang i signal over tid lik prøver med substrat. På grunn av dette ble metoden forkastet. CBP21 og EfCBM33 er begge aktive på kitin, svært like i struktur og funksjon og deres 3D-strukturer er nesten identiske. Dette ble utnyttet i en studie for å sammenlikne stabiliteten til EfCBM33 i forhold til CBP21. CBP21 har to disulfidbroer, mens EfCBM33 har ingen. Dette kan være en indikasjon på forskjeller i stabiliteten. En denaturerings metode ble utviklet ved hjelp av sirkulær dikroisme(SD) og fluorescens der parametere som protein konsentrasjon og oppvarmings hastigheter ble variert. SD viste seg å være et ugunstig verktøy for å måle denatureringen av CBP21 og EfCBM33, og ble derfor ikke brukt rutinemessig i denne studien. SD eksperimentet indikerte lik stabilitet mellom de to villtype enzymene. Måling av indre fluorescens på CBP21 og EfCBM33 med en temperatur økning på 20-80 °C ga gode denaturerings kurver. Disse kurvene ble beregnet ut ifra en tilsynelatende protein- smeltetemperatur. Den tilsynelatende smelte temperaturene mellom CBP21 og EfCBM33 viste å ha en liten forskjell på 2 °C. DTT reduserte CBP21 stabiliteten med 6.2 °C og EfCBM33 stabiliteten med 1.5 °C, noe som indikerer at disulfidbroer bidrar til CBP21 sin stabilitet. Angivelig inneholder EfCBM33 andre stabiliserende interaksjoner som kompenserer for de to manglende disulfidbroene. Av de forskjellige toverdige metall ionene som ble testet var det sink ioner som viste en klar endring i den tilsynelatende smeltetemperaturen. Noe som viser at toverdige metaller påvirker CBP21s denaturerings prosess, til hvilken grad og hvordan gjenstår fremdeles å undersøke. Det er kjent at toverdige metall ioner er svært viktig for enzym aktiviteten til forskjellige enzymer. I den siste delen av studiet, ble det forsøkt å skape en mer stabil CBP21 variant ved å introdusere konstruerte entropiske mutasjoner ett enkelt sted i aminosyre sekvensen. Denne mutasjonen var tenkt å gjøre enzym strukturen mer rigid. Av de tre mutasjonene som ble konstruert, G73A, A130P og A155P var det A130P variasjonen som ga en økning i den tilsynelatende smelte temperaturen. Denne økningen var på 2.2 °C. CBP21 A130P er den første CBM33 mutanten noen sinne som har blitt rapportert som en varmestabil mutant. This thesis describes the results of studies on the functionality and stability of CBM33 proteins. These proteins were originally defined as “Carbohydrate-Binding Modules”, but it has recently been discovered that CBM33 proteins in fact are enzymes capable of cleaving polysaccharides using a combination of oxidation and hydrolysis. Some CBM33s work on chitin (Vaaje-Kolstad et al., 2005a,b, 2010), whereas others work on cellulose (Forsberg et al., 2011). The CBM33 proteins act synergistically with classical hydrolytic enzymes (i.e. chitinases, cellulases) and their use may speed up enzymatic degradation processes. Since these enzymes may be exploited for more efficient enzymatic conversion of recalcitrant biomass, they are of great scientific and commercial interest. Here we studied the CBM33 proteins CBP21, from the soil bacterium S.marcescens and EfCBM33 produced by Enterococcus faecalis a natural inhabitant of the mammalian gastrointestinal track and an opportunistic bacterium frequently often seen in hospital infections. CBP21 acts on the insoluble polysaccharide β- chitin, one of the most widespread polymers in the world. In this study we have first tried to develop a novel method to see how effective CBP21 can bind β-chitin. The goal was to develop a more efficient assay by online monitoring of fluorescence signals as the enzyme binds to the β-chitin. The idea was then to use this assay to see whether this enzyme could bind more efficiently by adding compounds such as metals and reductants. Unfortunately, this method did not work as planned. Signals were unstable and not reproducible, and control reactions (i.e. with the enzyme but without the substrate) showed a similar decline in the signal over time as the sample with substrate. Therefore, this method was rejected. CBP21 and EfCBM33 are very similar chitin-active enzymes, with similar functions; their 3D structures are almost identical. This was exploited in a comparative study to compare the stability of EfCBM33 relative to CBP21. CBP21 has two disulphide bridges while EfCBM33 has none, which could indicate stability differences. Unfolding assay were developed using both circular dichroism (CD) and fluorescence and by varying parameters such as the protein concentration and the heating rates. CD turned out not to be an optimal tool in measuring unfolding of CBP21 and EfCBM33 and was not routinely used in this study. The CD experiments did indicate approximately similar stabilities for the two wild-type enzymes. Measurements of intrinsic fluorescence upon a temperature increase from 20 to 80 °C yielded good apparent unfolding curves. The results did not show large differences in protein stability between the two enzymes, the difference in apparent melting temperature being 5 Abstract less than 2°C. DTT decreased CBP21 stability by 6.2 °C and EfCBM33 stability by only 1.5 °C, indicating that the disulfide bridges do contribute to CBP21 stability. Apparently, EfCBM33 contains other stabilizing interactions that compensate for the lacking two disulfide bonds. Of different bivalent metal ions tested, zinc ions induced a marked change in the unfolding curve, however without giving a clear change in the apparent melting temperature. This shows that metal ions do affect CBP21 unfolding behavior, but how exactly remains to be studied. It is known that divalent metals very important for enzyme activity. In the final part of the study, attempts were made to create more stabile CBP21 variants by introducing designed single site entropic mutations that are thought to make the enzyme structure more rigid. Of three designed entropic mutations, G73A, A130P and A155P led to a 2.2 increase in the apparent Tm. CBP21 A130P is the first ever reported thermo-stabile mutant of CBM33.