Characterization of the multi-modular family 20-β-N-Acetylhexosaminidase (chitobiase) from Serratia Marcescens

Abstract

The aim of this study was to clone and characterize the N-acetylhexosaminidase (Chitobiase) from the soil bacterium Serratia marcescens. This enzyme is part of the chitinolytic machinery of S. marcescens, a Gram-negative bacterium known for its efficient degradation of chitin in nature. Research on understanding how this machinery works will provide knowledge that may be useful in the production of several chitin-derived compounds, and, thus, for utilization of the abundant resource that chitin represents. The knowledge of chitin degradation can also be used for better understanding the process of degradation of other carbohydrates, such as cellulose, which also represents a great resource, as it has potential in replacing fossil fuels. After successful cloning, expression and purification of the enzyme, kinetic analyses of its properties were performed with both artificial and natural substrates. The kinetic parameters calculated for the artificial and natural substrate were similar: KM = 52 +/- 3.545 μM (4-MU-GlcNAc), KM = 55 +/- 9.17 μM (GlcNAc2) and Kcat =129 +/- 2.517s -1 (4-MU-GlcNAc), Kcat = 135 +/- 5.975 s -1 (GlcNAc2), an observation that provides insight into the rate-limiting step in the catalytic mechanism of Chitobiase. Experiments on degradation of β-chitin did not reveal any synergistic effects when combining chitinases and Chitobiase. The rate of β-chitin degradation by Chitobiase increased when incubated together with CBP21 (in presence of reduced glutathione), a recently discovered oxidohydrolytic enzyme that disrupts crystalline substrates. To further understand the interplay between the various chitinolytic enzymes, the hypothesis that chitooligosaccharides bind to α- or β- chitin, thereby possibly inhibiting efficient chitin degradation by chitinases and possibly creating a role for Chitobiase, was tested. However, these experiments did not reveal any binding. Pulldown experiments with the recombinant Chitobiase, and a preliminary secretome analysis of S. marcescens were performed to investigate possible interaction partners of Chitobiase as well as hitherto unknown contributors to the III chitinolytic machinery of S. marcenscens. The pulldown experiment resulted in cleavage of the recombinant Chitobiase, as proteolytic cleavage product of the enzyme were identified by MALDI-TOF MS. This was probably due to a protease in the bacterial extract/supernatant. The preliminary experiment on the secretome of S.marcescens should be optimized before making any conclusions of the secreted proteins, and by repeating this experiment with more optimized conditions could reveal important contributors to the efficient chitinolytic machinery of S. Marcescens. Valuable knowledge concerning the N-acetylhexosaminidase (Chitobiase) from S. marcescens has been elucidated in this study, but there are still many questions concerning this large enzyme, especially with regard to the functions of its four distinct domain.Målet med denne studien var å klone og karakterisere N-acetylhexosaminidase (Chitobiase) fra Serratia marcescens. Dette enzymet er en del av det kitinolytiske maskineriet til jordbakterien Serratia marcescens, en Gram negativ bakterie kjent for sin effektive nedbrytning av kitin i naturen. Forskning basert på forståelse av hvordan dette maskineriet fungerer, vil bidra med kunnskap som kan brukes i produksjonen av nyttige forbindelser, og i utnyttelsen av kitin, som utgjør en stor ressurs. Denne kunnskapen kan også overføres til å forstå nedbrytning av andre karbohydrater, for eksempel cellulose, som også er en stor ressurs, særlig med tanke på dets potensiale i biodrivstoff industrien, hvor det kan erstatte fossile brennstoff. Kinetiske analyser av enzymets aktivitet ble utført bade med kunstig og naturlig substrat. De kinetiske parametrene som ble kalkulert for det kunstige og det naturlige substratet var veldig like, og er interessante med tanke på å forstå hva som bestemmer hastigheten av reaksjonen som foregår: KM = 52 +/- 3.545 μM (4-MU-GlcNAc), KM = 55 +/- 9.17 μM (GlcNAc2) og Kcat =129 +/- 2.517s -1 (4-MU-GlcNAc), Kcat = 135 +/- 5.975 s -1 (GlcNAc2) Forsøk med nedbrytning av β-kitin viste ingen synergistiske effekter med kitinasene og Kitobiase, men nedbrytning av β-chitin med Kitobiase og CBP21 (og reduktant) økte nedbrytningsraten sammenliknet med nedbrytning med Chitobiase alene. CBP21 er et nylig oppdaget oksidohydrolytisk enzyme som bryter opp krystallinske substrater. For å undersøke mulige interaksjonspartnere til Kitobiase og hittil ukjente bidragsytere til det kitinolytiske maskineriet til Serratia marcenscens, ble det foretatt “pulldown” forsøk med den rekombinante Kitobiase, og en innledende sekretomanalyse. ”Pulldown” forsøket resulterte i kløyvning av den rekombinante Kitobiasen, proteolytiske produkter av enzymet ble identifisert ved hjelp av MALDITOF MS. Mest sannsynlig var den en protease i bakteriecelleekstraktet/supernatanten som kløyvet Kitobiasen. Eksperimentet som omhandlet sekretomanalyse av S. Marcescens bør optimaliseres før man si noe om sekretomet til bakterien. Et V optimalisert forsøk kan bidra med viktig kunnskap om mulige bidragsytere til det effektive kitinolytiske maskineriet til S.marcescens. Denne studien har bidratt med verdifull kunnskap om S.marcescens Kitobiase, men det er fortsatt flere uløste spørsmål rundt dette store enzymet, særlig med tanke på funksjonen til dets fire distinkte domener.