| dc.description.abstract | Hovedmålet med oppgaven var å teste ulike prosedyrer for fraksjonering av celler. Ved å identifisere og kvantifisere proteinuttrykk ved hjelp av LC-MS (væskekromatografi-massespektrometri) som metode kan man bestemme fraksjoneringseffektiviteten til hver enkelt fraksjonerings metode. Subcellulær fraksjonering av proteiner ble delt inn i membran-, cytosol-, cytoskjelett/mitokondrie- og cellekjernekomponent. Det ble brukt Tert celler, som er mesenchymale stamceller Proteinene i de ulike fraksjonene ble separert med hensyn på masse ved SDS-PAGE. Hver brønn i gelen for de individuelle subcellulære fraksjonene ble delt i ti og proteinene ble ekstrahert ut av gelen og hydrolysert ved hjelp av proteasen trypsin. Videre ble peptidene separert og analysert med væskekromatografi-elektrosprayioniserings-massespektrometri/massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).Peptidene fra hver fraksjon ble analysert med oppsett І (tabell 2). Oppsettet ga 361 proteintreff for det kommersielle fraksjoneringskitet ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction kit og 41 proteintreff for manuell fraksjoneringsmetode. Et delmål til oppgaven var å utvikle en metode for å kontrollere at seterettet mutagenese blir riktig utført. Kitinase B (ChiB) fra jordbakterien Serratia marcescens og mutanter av denne ble benyttet som modellproteiner. Det ble gjort tre forskjellige forsøk på å kontrollere at mutasjonen fant sted på riktig plass ved hjelp av Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, High Performance Liquid Chromatography (MALDI, HPLC) og kjemisk merking av mutantene.
Innvirkning ulike matriksløsninger hadde på ioniseringen av mutantene ble undersøkt og viste at det var små forskjeller i hvor lett det var å identifisere mutantene med de forskjellige matriksene. Sinapinic acid mettet med Ta30 (30% ACN (100%),70% TFA (0,1%)) ble ansett å være bedre enn sinapinic acid mettet med ETOH.
HPLC koblet med massespektrometri ble benyttet for å separere og detektere proteinene i prøvene. Hver av de syv trypsinerte proteinene ble analysert ved
hjelp av LC-MS, og sekvensene for hver mutant ble satt inn i tabell 3-9. Vi har i våre innstillinger godtatt 1 feilkløyving (missed cleavage). Feilkløyving innbærer at trypsin, som er en spesifikk serinprotease, ikke kløyver ved alle R eller K i peptidet slik den skal, men ”hopper” over en aminosyre. Dette fører til flere mulige treff når man søker i databasen, og er årsaken til at tabellen inneholder mer enn en sekvens for hvert muterte peptid. Dette er en viktig innstilling da man ofte ser at trypsin ikke er 100 % effektiv. Det ble brukt to kjemisk derivatiserings metoder (SPITC og Lys-Tag) for trypsindegraderte proteiner etterfulgt av identifisering ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri. Lys-Tag legger til en endring i massen på +68 Da i ε-amino gruppen av lysin, og omdanner denne til imidazole ring. SPITC har en større forskyvning på +215 Da.
Derivatisering ble utført på ChiB-W220A (figur 4.18 og 4.19), men resultatene var ikke som ønsket da vi ikke fikk den ønskede forskyvningen på +68 Da for Lys-Tag og heller ikke +215 Da for SPITC. The
main goal with this master thesis is to test
different procedures for fractionation of
cells. By identifying and quantify protein
expression with help of liquid
chromatography-‐mass spectrometry
(LC-‐MS) as a method, can we decide
the effectiveness of fractionation in
each fractionation method. Subcellular
fractionation of proteins was divided
in to a membrane component, cytosol
component, cytoskeleton component
and nuclear component. It was used
Tert cells, which is mesenchymale
stem cells. Proteins from the various
fractions were separated in terms
of molecular weight by SDS-‐PAGE.
Each gel lane from the individual
subcellular fractions was divided in ten
and the proteins were extracted from
the gel and hydrolyzed with the protease
trypsin. Further on, the peptides were
separated and analyzed with liquid
chromatography-‐electrospray ionization-‐
mass spectrometry/ mass spectrometry
(LC-‐ESI-‐MS/MS). The peptides from
each fraction were analyzed using LC-‐ESI-‐MS/MS setups (setupІ). SetupІ detected
361 proteins for the commercial
fractionationkit ProteoExtract®
Subcellular Proteome Extraction kit and
41 proteins from manual fractionations
method. A part goal with this master
thesis is to develop a method that makes
it easier to control Site directed mutagenesis
and sees if this has been correct accomplished. Chitosan B (ChiB) from
Serratia marcescens, can be found in
environments such as dirt and mutants
form this was used as model proteins.
Bye using three different methods,
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization,
High Performance Liquid Chromatography
(MALDI, HPLC) and Chemical Derivatization
of mutants, we could se if the mutation
was done correctly. The influence
different matrix-‐solutions had on the
ionization of mutants were examined.
This showed that it was very little
difference in how easy it was to identify
the mutants by using different matrix-‐solutions. Sinapinic acid saturated
with Ta30 (0%ACN(100%), 70% TFA (0,1%)) was esteemed better
then sinapinic acid saturated with ETOH.
ABSTRACT VIII We used HPLC coupled
with mass spectrometry to separated
and detect proteins in a solution. The
settings were put to find all the sequences
opportunities with and without missed
cleavage. By missed cleavage we
mean setting the number of allowed
missed cleavage sites to zero simulates
a limit digest. We are not confident
that our digest (trypsin) is perfect,
with no partial fragments present,
this will give maximum discrimination
and the highest score. We can also se
in the table 3-‐9 that we can control
that the mutation has happened in
the right spot for the mutants ChiB-‐F190A,
ChiB-‐F191A and for the double mutant
ChiB-‐W97A/W220A. We used to chemical
derivatization methods (SPITCand Lys-‐Tag) for trypsin degradated proteins
followed bye identifying proteins by
MALDI-‐TOF mass spectrometry. Lys-‐Tag
makes a different in the mass of +68
Da and makes the ε-‐amino group
of lysin to an imidazole ring. SPITC
has a little bit bigger different in the mass,
+215 Da. Derivatization was accomplished
on the mutant ChiB-‐W220A (figure 4.18
and 4.19), but the result was not approvable
because we could not see the different
in the mass of +68 Da for Lys-‐Tag,
and +215 Da for SPITC. | en_US |
