Interaksjoner mellom kitooligosakkarider og kitinase B fra Serratia marcescens studert ved overflateplasmonresonans og isotermisk titreringskalorimetri.

Abstract

Hovedmålet i dette studiet var å sammenligne bruk av isotermisk titreringskalorimetri (ITC) og overflateplasmonresonans (SPR) ved bindingsstudier mellom KitinaseB(ChiB) og kitooligosakkarider (KOS) av ulik lengde. Det ble utført forsøk med N-acetyl-D-glukosamin ((GlcNAc)3, (GlcNAc)4 og (GlcNAc)6) med ChiB-E144Q på Biacore. Det ble brukt to ulike immobiliseringsmetoder av proteinet. De samme KOS ble også studert på ITC ved 18 °C. Begge immobiliseringsmetodene ga samsvarende resultater med resultatene fra ITC. Det var derfor mulig å kombinere informasjonen fra ITC og SPR til å gi et bilde av interaksjonene mellom protein og ligand. Resultatene fra SPR tyder på at assosiasjonsraten, ka, øker med økende substratlengde. Dette er som forventet, da lengre substrater har flere gunstige interaksjoner med enzymet. Det ser ut til at dissosiasjonsraten, kd, er uavhengig av substratlengden. Dette kan skyldes at dissosiasjon av uspaltede oligomere domineres av det som skjer i -2 til +1 subsetene. Neste mål var å kartlegge bindingsenergiene i de ulike subsetene hos ChiB. Ved å kombinere resultatene fra denne studien med tidligere resultater for (GlcNAc)5 og ChiB-E144Q (Norberg et al. 2010), var det mulig å beregne de ulike bindingsenergiene. Endringen i Gibbs fri energi (ΔG) ble funnet til å være -0,2 kJ/mol, -22,8 kJ/mol, -8,0kJ/mol, -3,9 kJ/mol og -0,9 kJ/mol for henholdsvis subsetene -3, (-2, -1 og +1), +2, +3 og ”+4”. Binding til subsetene -2, -1 og +1 er hovedsakelig entalpisk drevet, mens binding i subsetene +2 og +3 er sterkt entropisk drevet. VI Abstract The aim of this study was to compare the use of Isotermal Titration Calorimetry (ITC) and Surface Plasmon Resonance (SPR) to do binding studies between Chitinase B (ChiB) and chitooligosaccharides (CHOS) of different length. Experiments were performed with Nacetyl- D-glucosamine ((GlcNAc)3, (GlcNAc)4 and (GlcNAc)6) with ChiB-E144Q on Biacore. Two different methods of protein immobilization were used. The same CHOS were also studied on ITC, at 18 °C. Both methods of immobilization gave good correspondence with the results from ITC. This allows a combined interpretation of the data, giving a picture of substrate binding in ChiB. The results from SPR indicate that the association rate, ka, increases with increasing substrate length. This is expected - as longer substrates have more favorable interactions with the protein. It looks like the dissociation rate, kd, is independent of the substrate length. The only way to explain this is that dissociation of the non-cleaved oligomers is dominated by what takes place in the -2 to +1 subsites. The next aim was to describe the binding energies in the individual subsites in ChiB. By combining results from this study with previously observed results for (GlcNAc)5 (Norberg et al. 2010), it was possible to calculate the binding energies. The change in Gibbs free energy (ΔG) was found to be -0.2 kJ/mol, -22.8 kJ/mol, -8.0kJ/mol, -3.9 kJ/mol and -0.9 kJ/mol for the subsites -3, (-2, -1 and +1), +2, +3 and ”+4”, respectively. Binding in the subsites -2, -1 and +1 are driven by enthalpy, whereas the binding in subsites +2 and +3 are driven by entropy.