Interplay between LPMOs and cellulases during enzymatic degradation of cellulose : effects of time, lignin, light and substrate concentration

Abstract

The recent discovery of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) marked a paradigm shift in our understanding of enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass. Under aerobic conditions, interactions between oxygen and redox-active components such as ascorbic acid or lignin produce the LPMO co-substrate H2O2. The presence of H2O2 is pivotal for maintaining LPMO activity during saccharification processes, but in situ production is challenging to regulate. This is problematic since H2O2 accumulation in the system may lead to reactive oxygen species production and inactivation of the enzymes. LPMOs’ flat active site surface facilitates direct oxidation in crystalline cellulose, which makes the substrate accessible to classical hydrolytic cellulases. However, the interplay between cellulases and LPMOs is still not fully understood, which restricts practical applications. The aim of this thesis was to improve our understanding of the LPMO-cellulase interplay by investigating the effects of time, light, lignin, and substrate concentration on LPMO activity and saccharification performance. This study is based on four research articles:

In Paper I, a positive effect of LPMO pretreatment on the productive binding capacity of a reducing end cellulase, TlCBHI, was demonstrated. Despite the fact that LPMO inactivation occurred before the first time point (5 h), a pronounced enhancement of TlCBHI's productive binding capacity on LPMO-pretreated cellulose was observed after 24 h. This indicates that the LPMO cleavage of the crystalline cellulose does not directly serve as new access points for cellulases but that this is followed by a non-enzymatic amorphization that makes the substrate accessible for cellulase activity.

In Paper II, the importance of maintaining LPMO activity throughout the reaction to ensure efficient cellulase activity, especially at high substrate loadings, was demonstrated. The positive effect of including LPMOs in a cellulase cocktail increased with dry matter concentrations and reaction time. The impact of LPMO regioselectivity varied depending on the substrate, but a clear increase in cellulose conversion was observed when combining C1 and C4 LPMO activity. The study also indicates that chelating of free copper with EDTA might hinder transition metal-induced side reactions following LPMO inactivation.

In Papers III and IV, light-exposed lignin was shown to promote LPMO activity on cellulose by improving in situ generation of H2O2 compared to similar reactions in the dark. These studies further demonstrated that the H2O2 production and thus LPMO activity could be controlled by lignin concentration, light intensity, and light-specific wavelengths. The findings of Paper III indicate that when lignin is exposed to light, it enhances LPMO activity by converting O2 to H2O2, most likely via O2•-. In contrast, the results in Paper IV showed that light exposure of lignin-containing reactions negatively affected cellulose saccharification by cellulolytic enzyme cocktails. Interestingly, LPMO activity could help mitigate this negative effect on the glucose yield by their productive H2O2 consumption, delaying the accumulation of reactive oxygen species and subsequent enzyme inactivation.

Den nylige oppdagelsen av lytisk polysakkarid monooxygenaser (LPMOer) markerte et paradigmeskifte i vår forståelse av enzymatisk sakkarifisering av lignocellulose. Under aerobe forhold blir LPMOenes ko-substrat, H2O2, produsert gjennom interaksjoner mellom oksygen og redoksaktive komponenter som askorbinsyre eller lignin. Tilstedeværelsen av H2O2 er avgjørende for å opprettholde LPMO-aktiviteten under enzymatisk sakkarifisering, men in situ produksjon av H2O2 er utfordrende å regulere. Dette er problematisk siden akkumulering av H2O2 i systemet kan føre til produksjon av reaktive oksygenarter og inaktivering av enzymene. LPMOenes flate aktive sete tillater direkte oksidasjon i krystallinsk cellulose og gjør dermed substratet mer tilgjengelig for klassiske hydrolytiske cellulaser. Imidlertid er samspillet mellom cellulaser og LPMOer fortsatt ikke helt forstått, noe som begrenser praktiske anvendelser. Målet med denne avhandlingen var å forbedre forståelsen vår om samspillet mellom LPMOer og cellulaser ved å undersøke effekter av tid, lignin, lys-eksponering og substratkonsentrasjon på LPMO-aktivitet og glukose-utbytte. Denne studien er basert på fire forskningsartikler:

I Artikkel I ble det vist at LPMO-forbehandling økte den produktive bindingskapasiteten til TlCBHI, en cellulase med affinitet for reduserende celluloseender. En markant økning i den produktive bindingskapasiteten til TlCBHI var synlig etter 24 t med LPMO-forbehandling, og dette til tross for at LPMOene var inaktivert allerede etter 5 t. Dette tyder på at LPMO-kutt i den krystallinske celluloseoverflaten ikke direkte fungerer som nye tilgangspunkter for cellulasene, men at LPMO-oksideringen er etterfulgt av en ikke-enzymatisk dekrystallisering som gjør substratet mer tilgjengelig for cellulase-aktivitet.

I Artikkel II ble det vist at stabil LPMO-aktivitet gjennom hele reaksjonsforløpet fremmer cellulase-aktivitet, spesielt ved høye substratkonsentrasjoner. Den positive effekten av å inkludere LPMO i cellulase-cocktailer økte i takt med substratkonsentrasjonen og gjennom reaksjonsforløpet. Effekten av C1- vs C4-aktive LPMOer varierte avhengig av substratet, men en tydelig økning i glukose-utbytte ble observert ved å kombinere C1- og C4-aktive LPMOer. Studien viste også at chelatering av fri kobber med EDTA kan forhindre sidereaksjoner med innskuddsmetaller som en følge av LPMO-inaktivering.

I Artikkel III og IV ble det vist at lys-eksponering av lignin fører til økt in situ H2O2-produksjon og dermed økt LPMO-aktivitet sammenlignet med reaksjoner i mørket. Disse studiene viste også at H2O2-produksjonen og LPMO-aktiviteten kunne kontrolleres ved hjelp av ligninkonsentrasjon, lysintensitet og lys-spesifikke bølgelengder. Artikkel III viste at lyseksponering av lignin økte omdannelsen av O2 til H2O2, mest sannsynlig via O2•-, og ga derfor økt LPMO-aktivitet. Samtidig viste resultatene i Artikkel IV at lys-eksponering av reaksjoner med lignin hadde en negativ påvirkning på cellulase-aktivitet. Tilstedeværelsen av LPMO kunne hjelpe til med å motvirke den negative effekten på glukoseutbyttet til cellulasene. Dette er mest sannsynlig et resultat av LPMOens konsumering av H2O2, som vil forsinke produksjonen av reaktive oksygenarter og enzym inaktivering.