The site-2-protease RseP as a novel antimicrobial target

Abstract

The discovery and development of antibiotics have revolutionized modern medicine. Today, several decades after the first patients were treated with antibiotics, bacterial infections are again becoming increasingly difficult to treat. The rapid appearance of antibiotic resistant bacteria has caused antibiotic agents to lose their efficacy, posing a serious threat to human health. To combat antibiotic resistant bacteria, novel treatment options are needed. Bacteriocins are small, antimicrobial peptides produced by bacteria to inhibit growth of other bacteria in competition for nutrients and/or habitats. Most notably, several bacteriocins show potent activity against multiple prominent human pathogens, highlighting their potential as novel antimicrobial agents. One such bacteriocin is enterocin K (EntK1), a member of the LsbB family of bacteriocins, exhibits particularly potent activity against vancomycin resistant enterococci. The antimicrobial activity of EntK1 depends on interaction with an intramembrane protease of the site-2-protease (S2P) family known as RseP. While EntK1 and other bacteriocins hold significant potential as novel antimicrobials, their clinical applications have so far been limited. Understanding the mechanisms of action and molecular details underlying target recognition and binding are essential steps toward developing bacteriocins as novel antimicrobial agents. This thesis aimed to investigate the molecular mechanism underlying EntK1 recognition and interaction with RseP, as well as explore the potential of the LsbB family as a basis for engineering novel bacteriocins.

Paper I comprehensively reviews the role of S2P in bacteria. The S2P family is highly conserved among Gram-positive and Gram-negative bacteria and play an essential role in physiology and virulence in multiple prominent human pathogens. Notably, S2P have been implied in virulence in multiple human pathogens, including Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis and Enterococcus faecalis. The prominent role of S2P highlights the potential of S2P as novel antimicrobial targets.

Paper II describes the design of a novel hybrid bacteriocin Hybrid 1 (H1), consisting of the N-terminal region of EntK1 and the C-terminal region of enterocin EJ97 (EntEJ97). H1 targets RseP and exhibits a distinct inhibition spectrum compared to the parental bacteriocins. Importantly, H1 showed superior antimicrobial activity against the human pathogen Staphylococcus haemolyticus and contributed to complete eradication of S. haemolyticus biofilm. Taken together, the results presented in paper II demonstrate that members of the LsbB family can be engineered to enhance potency and/or alter the activity spectrum.

Paper III describes a mutational analysis of Enterococcus faecium RseP. To identify regions involved in EntK1 sensitivity and binding, conserved motifs related to substrate binding and catalysis were targeted. Mutational effects were assessed by investigating EntK1 sensitivity and binding using the naturally EntK1-resistant Lactiplantibacillus plantarum as a host for expressing several variants of RseP. The mutational analysis revealed that EntK1 depends on interactions with the extracellular PDZ domain and the third transmembrane helix, particularly the residue Asn359, for its antimicrobial activity. The results from paper III provided valuable insights into mechanisms underlying EntK1:RseP interaction. However, increased structural characterization of E. faecium RseP would further contribute to our understanding of EntK1:RseP interaction and mode of action of this bacteriocin. Paper IV describes the pSIP system and L. plantarum as a novel platform for production and purification of integral membrane proteins. Integral membrane proteins, such as RseP, are notoriously difficult to express and purify. Structural characterization often requires large amount of protein, thus establishing a reliable protocol for purification of stable RseP with high purity is an important milestone in the efforts of structural characterization. Paper IV thus describes an efficient protocol for production and purification of integral membrane proteins using the pSIP-system and L. plantarum. The protocol does not only lay the foundation for further structural and biochemical characterization of E. faecium RseP but may serve as a platform for production and purification of other membrane proteins.

Taken together, the work presented in this thesis (i) highlights the key role of S2P in prominent human pathogens and the potential of S2P as antimicrobial targets (Paper I), (ii) show that bacteriocins of the LbsB family can be engineered to improve potency and altered activity spectrum (Paper II), (iii) provide detailed insight into the EntK1:RseP interaction (paper III), and (iv) establishes an expression and purification platform needed for structural characterization of RseP (Paper IV).

Oppdagelsen og utviklingen av antibiotika er et av de største fremskrittene i medisinsk historie. I dag, flere tiår etter de første pasientene ble behandlet med antibiotika, er bakterielle infeksjonssykdommer igjen blitt et økende problem. Stadig flere bakterier blir motstandsdyktige (resistente) mot antibiotika, som fører til at flere typer antibiotika mister sin effekt. Utvikling av nye behandlingsmetoder mot antibiotikaresistente bakterier er derfor avgjørende. Bakteriosiner er små antimikrobielle peptider som produseres av bakterier for å hemme veksten av andre, konkurrerende bakterier i kampen om habitat og næring. Flere bakteriosiner har vist seg å effektivt hemme veksten av flere ulike patogene bakterier. Enterocin K1 (EntK1) er medlem av bakteriosinfamilien LsbB, og er spesielt effektiv mot vancomycinresistente enterokokker. Den antimikrobielle aktiviteten til EntK1 avhenger av interaksjonen med RseP på målcellens overflate. RseP er et transmembranprotein tilhørende proteinfamilien kalt posisjon-2-protease (S2P). Selv om EntK1 og andre bakteriosiner viser god effekt mot flere humane patogen, har så langt få bakteriosiner blitt tatt i bruk i klinisk sammenheng. Et viktig steg i utviklingen av bakteriosiner som nye, mulige behandlingsmetoder, er en økt forståelse av hvordan bakteriosinene gjenkjenner og binder til målproteinet. Denne avhandlingen hadde derfor som mål å undersøke de molekylære mekanismene involvert i EntK1:RseP interaksjonen, samt vurdere potensialet til medlemmer av LsbB familien som et utgangspunkt for design av nye bakteriosiner.

Artikkel I gir en detaljert sammenfatting av rollen til S2P i bakterier. S2P finnes i både Gram-positive og Gram-negative bakterier og spiller en viktig rolle for bakteriens evne til å respondere på endringer i miljøet og til å etablere infeksjon. S2P har vist seg å være viktig for etablering av infeksjon for en rekke patogene bakterier, blant annet Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis og Enterococcus faecalis. S2P viktige rolle i infeksjon fremhever S2P som et nytt, mulig antimikrobielt angrepspunkt.

Artikkel II beskriver konstruksjonen av et nytt bakteriosin kalt Hybrid 1 (H1). H1 består av den C-terminalen-delen av EntK1 og den N-terminale delen av enterocin EJ97 (EntEJ97). Den antimikrobielle aktiviteten til H1 er avhengig av binding til RseP på mottakercellens overflate. Sammenlignet med EntK1 og EntEJ97, som også binder til RseP, har H1 et unikt inhiberingsspektrum. H1 er spesielt aktiv mot Staphylococcus haemolyticus og bidro sammen med to andre bakteriosiner til å fullstendig hemming av biofilm dannelse. Resultatene presentert i Artikkel II viser at det er mulig å modifisere medlemmer av LsbB familien slik at de antimikrobielle egenskapene forbedres.

Artikkel III beskriver en mutasjonsanalyse av RseP fra Enterococcus faecium. For å undersøke hvilke områder av RseP som er involvert i EntK1:RseP interaksjonen, ble det introdusert mutasjoner i områder som i tidligere studier er vist viktig for substrat interaksjon. Effekten av de ulike mutasjonene ble evaluert ved å benytte Lactiplantibacillus plantarum, som er resistent mot EntK1, som en vert for uttrykk av ulike varianter av RseP i kombinasjon med bindings- og sensitivitets analyser. Resultatene fra Artikkel III viser at et område kalt PDZ domenet og aminosyre 359 i den tredje transmembranheliksen er viktig for den antimikrobielle aktiviteten til EntK1. Økt kunnskap om strukturen til RseP vil gi dypere innsikt i interaksjonen mellom EntK1 og RseP.

Artikkel IV beskriver hvordan pSIP systemet og L. plantarum kan benyttes i produksjon og rensing av transmembranproteiner. Transmembranproteiner, slik som RseP, er svært krevende å rense. For å gjennomføre karakterisering av proteiners tredimensjonale struktur kreves det store mengder, rent protein. Derfor er etableringen av en effektiv protokoll for produksjon og rensing av RseP er den første milepælen på vei mot strukturell karakterisering av RseP. Artikkel IV beskriver en effektiv protokoll for rensing av transmembranproteiner ved bruk av pSIP-systemet og L. plantarum. Denne protokollen legger grunnlaget for videre biokjemiske og strukturelle studier av RseP, men vil også kunne benyttes for produksjon og rensing av andre transmembranproteiner.

Til sammen viser resultatene i denne avhandlingen: (i) S2P spiller en viktig rolle i bakterier og kan være nye antimikrobielle angrepspunkt (Artikkel 1), (ii) enkle modifikasjoner kan forbedre og/eller endre den antimikrobielle aktiviteten til medlemmer av LsbB familien (Artikkel II), (iii) gir økt forståelse av interaksjonen mellom EntK1 og RseP (Artikkel III), og (iv) etablerer en ny protokoll for produksjon og rensing av membranproteinet RseP (Artikkel IV).