Impact of dietary components and reactive oxygen species (ROS) in the colon and its microbiota in a low-grade inflammation mouse model

Abstract

Background: Various factors, including dietary components, the gut microbiota and host responses, are imperative for gut health. Optimal interactions between diet, gut microbiota and host are suggested to be important to avoid imbalanced gut microbial ecosystems and low-grade inflammation. Dietary fiber components, in particular, have been highlighted for their positive effects on the microbiota and gut inflammation status. Furthermore, although high-fat diets, mainly based on animal fat, have been associated with gut inflammation it is not clear to what extend different fat sources (i.e., animal type), and modes of fat intake affect the gut inflammatory process. Objectives: The overall aim of the current thesis was to investigate the differential impact of fiber and protein fractions from faba beans and different fat types on the microbiota composition and gut health in mice with and without low-grade inflammation in the gut. Another aim was to assess the role of reactive oxygen species (ROS) induced by NADPH oxidase 1 (NOX1) for low-grade gut inflammation and microbial community in the colon. Methods: After the establishment of a low-grade inflammation model with the chemical dextran sodium sulfate (DSS) feeding trials with C57BL/6J mice were performed. Besides the wild type (WT), C57BL/6J, mice deficient in the NOX1 gene were used (NOX1-KO mice). The diets offered during the mouse experiments varied in macronutrient composition and energy intake. Briefly these diets were: a standard mouse diet (chow diet), a synthetic low-fat diet (LFD), a purified western diet (WD) and modified western diets (WDs), in which defined fractions from faba beans were incorporated. These fractions were protein fraction (PF) and fiber fraction (FF) that replaced partially casein and cellulose substances in WDs, respectively. Body weight, colon length, gene expression of inflammatory and reactive oxygen species related genes, biomarkers of inflammation in blood and fecal sample were parameters to be examined. Shifts of the colonic microbiota populations in phylum and genus level upon the termination of experiments were additionally evaluated using LEfSe (Linear discriminant analysis Effect Size). Results: In Paper I, we established the low-grade inflammation mouse model and showed that NOX1 plays a significant role in ROS formation in the colon during pathogenesis towards the status of low-grade inflammation. We demonstrated that NOX1 modulates the colonic microbiota both in a steady-state (healthy) and during low grade inflammation. Also, while absence of NOX-1 did not influence the pathology scores, the inflammation-related genes and lipocalin 2 (LCN-2) expression tended to be higher in NOX1 deficient mice than in WT mice. From these results we conclude that NOX1-dependent ROS production is important for shaping microbiota composition and for protecting against insults to the colon. In Paper II, we compared the impact of a low-fat diet (LFD) and different western diets (WD) with fat from various sources on colon health in low-grade inflammation. We falsified the hypothesis that WD fed mice would manifest more severe symptoms compared to LFD fed mice as we observed that LFD mice were more susceptible to DSS-induced inflammation and revealed a less diverse microbiota with increased relative abundance of the Proteobacteria phylum compared to WD fed mice. Both fat sources (milk and lard) tested as part of the WD induced similar immediate ‘protective’ effect as compared to the LFD. Because these results contradict many other studies, we suspect that the higher fat content protects against the establishment of the DSS-induced low-grade inflammation. Therefore, we raise the concern that the DSS model of mouse inflammation might be unfit for the purpose of studying the differential impact of dietary fats. In Paper III, we investigated possible metabolic and colonic beneficial effects of faba bean protein and fiber fractions when ingested as part of a WD. Although the diets were isocaloric the mice that ingested diets with added faba bean protein content (WD+PF and WD+BF) had a higher increase in body weight compared to the pure WD or the WD+FF. However, no differences were revealed in glucose and insulin tolerance test between dietary groups. Also, neither the protein nor the fiber fraction protected against DSS induced low-grade gut inflammation as compared with mice fed a pure WD. Furthermore, marginal changes were found in the microbiota at the genus level. Conclusions: Collectively, our results demonstrate a role for ROS in the healthy gut and in response to DSS induced inflammation which may be related to controlling and shaping the microbiota. Furthermore, unexpectedly, we found that a high fat content in the diet protected against DSS induced inflammation as compared with the LFD group and speculate that the high fat content confounds the establishment of the DSS induced low-grade inflammation model. Also, a WD with a higher protein fraction from faba bean resulted in even higher gain of weight compared to standard WD. Only marginal changes were found for the microbiota composition when increasing the fiber fraction of the WD and it did not protect against weight gain.

Bakgrunn: Ulike faktorer, slik som næringsstoffer, tarmmikrobiota og biologiske vertsresponser, er avgjørende for tarmhelsen. Optimal interaksjon mellom disse er viktig for å unngå ubalanserte mikrobielle tarmøkosystemer og lavgradig betennelse. Særlig har kostfiber blitt fremhevet som viktig og positiv for både mikrobiota og tarmbetennelsesstatus. I tillegg, selv om kosthold med høyt fettinnhold fra animalske kilder har vært assosiert med tarmbetennelse, er det ikke entydig klart i hvilken grad ulike fettkilder (dvs. dyretype), og inntak av fett som sådan påvirker betennelse i tarm. Mål: Det overordnede målet med denne oppgaven var å undersøke i hvilken grad fiber- og proteinfraksjoner fra fababønner og ulike fetttyper påvirket mikrobiotasammensetningen og tarmhelsen hos mus med og uten lavgradig betennelse i tarmen. Et annet mål var å evaluere rollen til reaktive oksygenforbindelser (ROS) indusert av NADPH-oksidase 1 (NOX1) for lavgradig tarmbetennelse og mikrobielle samfunn i tykktarm. Metoder: Etter etablering av en lavgradig inflammasjonsmodell med det kjemiske stoffet dekstran-natriumsulfat/dextran sodium sulfate (DSS) ble det utført fôringsforsøk med C57BL/6J-mus. I tillegg til å bruke villtypemus (WT), ble C57BL/6J-mus uten uttrykk av NOX1-genet benyttet (NOX1-KO-mus). De ulike fôrtypene som ble brukt under museforsøkene varierte i sammensetning av makronæringsstoffer og energiinnhold. Fôrtypene bestod (i korthet) av: standard musefôr også kalt chow, lav-fettdiett (LFD), en vestlig høy-fettdiett (WD) og modifiserte vestlige dietter, der fraksjoner fra faba bønner ble inkorporert. Disse fraksjonene var proteinfraksjon (PF) og fiberfraksjon (FF) som delvis erstattet henholdsvis kasein- og cellulose i WD-fôrtypene. Alle fôrtypene med unntak av chow var kontrollerte (kjent innhold av alle næringsstoffene og ingrediensene). Chow-fôret er mer udefinert fordi det er satt sammen av hele råvarer. Kroppsvekt, tykktarmslengde, genuttrykk av inflammatoriske og ROS-relaterte gener, biomarkører for betennelse i blod og avføringsprøver var parametere som skulle undersøkes. Endringer av tykktarmens mikroflora ved avslutning av eksperimenter ble i tillegg evaluert ved bruk av såkalt LefSe (Linear discriminant analysis Effect size). Resultater: I Artikkel I (Paper I) etablerte vi musemodell for lavgradig inflammasjon og viste at NOX1 spiller en betydelig rolle i ROS-produksjon i tykktarmen under lavgradig betennelse indusert med DSS. Vi viste også at NOX1 modulerer tykktarmsmikrobiotaen både i en ‘steady-state’ (sunn) og under lavgradig betennelse. Videre så vi at, mens fravær av NOX-1 ikke påvirket patologi, hadde de betennelsesrelaterte genene og uttrykk av lipocalin 2 (LCN-2) en tendens til å være høyere i NOX1-knockout mus enn i WT-mus. Fra disse resultatene konkluderer vi med at NOX1-avhengig ROS-produksjon er viktig for å forme mikrobiotasammensetning og for å beskytte mot skader i tykktarmen. I Artikkel II (Paper II) sammenlignet vi effekten av en lav-fettdiett (LFD) og ulike vestlige dietter (WD) med fett fra ulike kilder på tykktarmshelsen ved lavgradig betennelse. Vi forkastet derfor hypotesen om at WD-fôrede mus ville manifestere mer alvorlige symptomer sammenlignet med LFD-fôrede mus da vi observerte at LFD-mus var mer mottakelige for DSS-indusert betennelse og avslørte en mindre mangfoldig mikrobiota med økt relativ tilstedeværelse av Proteobakterier (fylum) sammenlignet med WD-fôrede mus. Begge fettkilder (melk og svinefett) testet som en del av WD førte i begge tilfeller til umiddelbar "beskyttende" effekt sammenlignet med LFD. Fordi disse resultatene motsier mange andre studier, mistenker vi at det høyere fettinnholdet beskytter mot etableringen av DSS-indusert lavgradig betennelse. Derfor reiser vi bekymringen for at DSS-modellen for musebetennelse kan være uegnet for det formål å studere den differensielle påvirkningen av fettrikt fôr med den hensikt å studere fysiologiske effekter av høyfett-dietter. I Artikkel II (Paper III) undersøkte vi potensielt metabolske effekter av proteiner og fiber (begge var fraksjoner) isolert fra fababønner som ble blandet inn WD-fôret. Selv om diettene var isokaloriske, hadde musene som inntok fôret beriket med proteiner fra fababønner (WD+PF og WD+BF) fant vi at disse musene hadde en høyere økning i kroppsvekt sammenlignet med ren WD eller WD+FF (fiberfraksjon). Imidlertid ble det ikke avdekket forskjeller i glukose- og insulinregulering mellom de ulike diettgruppene. Heller ikke protein- eller fiberfraksjonen fra fababønner beskyttet mot DSS induserte lavgradig tarmbetennelse sammenlignet med mus som ble fôret med en ren WD. Videre ble det funnet marginale endringer i mikrobiotaen på slektsnivå. Konklusjoner: Samlet viser resultatene våre en rolle for ROS i den sunne tarmen og som respons på DSS-indusert betennelse som kan være relatert til å kontrollere og forme mikrobiotaen. Videre, og noe uventet, fant vi at et høyt fettinnhold i kostholdet (WD) beskyttet mot DSS-indusert betennelse sammenlignet med LFD-gruppen og spekulerer i at det høye fettinnholdet påvirker etableringen av den DSS-induserte lavgradige betennelsesmodellen, muligens direkte. Dessuten resulterte en WD med en høyere proteinfraksjon fra fababønne i enda høyere vektøkning sammenlignet med standard WD. Bare marginale endringer ble funnet for mikrobiotasammensetningen ved tilsetning av fiberfraksjonen til WD, og den beskyttet ikke mot vektøkning.