Understanding and optimizing the role of lytic polysaccharide monooxygenases in enzymatic conversion of lignocellulosic biomass

Abstract

Lignocellulosic biomass holds great potential for production of biofuels and other chemicals traditionally produced from fossil fuels. However, its significant recalcitrance presents a substantial challenge in industrial biorefining, where chemical and/or physical pretreatment methods and enzymatic saccharification are used to convert the polysaccharides within the lignocellulosic structure to fermentable sugars. One way of overcoming this innate recalcitrance is by developing strategies for improved enzymatic conversion, via process optimization or by exploring new enzyme activities.

The discovery of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and their role in plant biomass degradation, and, more recently, the ability of these enzymes to catalyze a fast and specific peroxygenase reaction, has altered our understanding of the mechanisms of lignocellulose depolymerization, and revealed new avenues for potential improvement of this process. However, achieving such improvement requires in-depth understanding of how LPMOs function, including their substrate specificities, their catalytic mechanism, and the conditions under which they perform best, both alone and during synergistic action with hydrolytic enzymes. In addition, for process improvement and general understanding of LPMO activity, we must be able to analytically interpret and quantify the complex product mixtures generated by LPMOs. The work presented in this thesis has addressed several of these topics both from a fundamental and an applied perspective.

Paper I of this thesis describes the implementation of a recently developed chromatographic platform for high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) using dual electrolytic eluent generation in analytical methods for separation and quantification of LPMO-generated carbohydrate products. In this platform, the eluents are based on potassium methanesulfonate and potassium hydroxide. We established methods for simultaneous detection of native, C1-, and C4-oxidized cello-oligosaccharides, as well as separate methods for analysis of gluconic and glucuronic acid. The developed methods showed increased sensitivity and precision in detection and quantification of LPMO products compared to traditional HPAEC-PAD using manually prepared eluents based on sodium hydroxide and sodium acetate.

In the study described in Paper II, we evaluated the use of a relatively simple, LPMO-rich fungal enzyme cocktail produced by Thermoascus aurantiacus in saccharification of pretreated lignocellulosic biomass, and showed that this cocktail performs nearly as well in saccharification of lignin-poor sulfite-pulped spruce at 60°C as the commercial cellulase preparation Cellic CTec2 at 50°C. These results underpin the potential of the T. aurantiacus fungus as a producer of enzymes for use in industrial biorefining processes, where maintaining higher temperatures during saccharification can be advantageous. Furthermore, addition of H2O2-producing glucose oxidase to saccharification reactions with Cellic CTec2 showed that in situ H2O2 production can drive LPMO activity in saccharification of lignin-poor substrates. The results obtained in this study were substrate-dependent: when using a lignin-rich substrate, the T. aurantiacus cocktail was less advantageous, and addition of glucose oxidase was detrimental to the saccharification efficiency of Cellic CTec2. These results highlight the importance of adapting process conditions to individual lignocellulosic feedstocks and enzyme preparations.

Paper III and Paper IV of this thesis describe the functional characterization of AA9 LPMOs. In Paper III, we demonstrate the C4-oxidizing activity of ScLPMO9A from Schizophyllum commune on a range of hemicellulosic substrates and soluble cellooligomeric substrates, including cellotetraose and cellohexaose (with apparent preferential -3 - +3 binding), and its strong peroxygenase activity when acting on soluble and insoluble amorphous substrates. In contrast to the traditionally-perceived role of LPMOs in depolymerization of crystalline substrates, ScLPMO9A appeared to have little-to-no activity on crystalline cellulose. Although further investigation of these observations is needed, including determination of potential active site residues that may contribute to the observed substrate preferences, these results are intriguing and may aid in providing insight into hitherto unknown biological roles of LPMOs. The research presented in Paper IV uncovered the glucuronoxylanolytic activity of two LPMOs from Neurospora crassa. By quantification of cellulose- and xylan-derived oxidized products, this study demonstrated that preferential cleavage of xylan or cellulose in a mixture of these two polysaccharides can vary substantially between xylan-active LPMOs, suggesting that these LPMOs may have evolved to target different co-polymeric structures within plant biomass. Phylogenetic analysis and structural modeling also enabled the identification of additional putatively xylan-active LPMOs.

The results reported in this thesis add to our understanding of LPMO action and how best to leverage this action for current and future academic and industrial applications.

Lignocellulose innehar et stort potensial for produksjon av biobrensel og andre kjemikalier som tradisjonelt produseres fra fossile kilder. Men dens komplekse sammensetning gir betydelige utfordringer i industriell bioraffinering, hvor kjemiske og/eller fysiske forbehandlingsmetoder og enzymatisk nedbrytning brukes for å omdanne polysakkaridene i lignocellulosen til fermenterbare sukkere. En måte å løse denne kompleksiteten på er å utvikle strategier for forbedret enzymatisk omdanning, via prosessoptimalisering eller ved å utforske nye enzymaktiviteter.

Oppdagelsen av lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMOer) og deres rolle i nedbrytning av plantebiomasse, og, nylig, evnen disse enzymene har til å katalysere en hurtig og spesifikk peroksygenasereaksjon, har endret vår forståelse av mekanismene for nedbrytning av lignocellulose, og åpnet opp for nye mulige forbedringer av denne prosessen. Dog, det å få til slike forbedringer krever mer kunnskap om hvordan LPMOer fungerer, inkludert deres substratspesifisiteter, den katalytiske mekanismen og om hvilke forhold de presterer best under, både alene og i synergi sammen med hydrolytiske enzymer. I tillegg, for å kunne forbedre prosessen og generelt forstå LPMO-aktiviteten, må vi kunne analysere og kvantifisere de komplekse produktblandingene som LPMOer gir. Arbeidet presentert i denne avhandlingen adresserer flere av disse temaene, både fra et fundamentalt og et anvendt perspektiv.

Artikkel I beskriver implementeringen av en nylig utviklet kromatografisk plattform for høypresisjons-ionebytterkromatografi med pulserende amperometrisk deteksjon (HPAEC-PAD) ved bruk av dobbel elektrolytisk eluentgenerering i analytiske metoder for separasjon og kvantifisering av karbohydratprodukter produsert av LPMOer. I denne plattformen er eluentene basert på kaliummetansulfonat og kaliumhydroksid. Vi etablerte metoder for samtidig deteksjon av native, C1- og C4-oksiderte cello-oligosakkarider, samt separate metoder for analyse av glukonsyre og glukuronsyre. Metodene som ble utviklet her viste økt sensitivitet og presisjon ved deteksjon og kvantifisering av LPMO-produkter sammenlignet med tradisjonell HPAEC-PAD, hvor eluentene lages manuelt og er basert på natriumhydroksid og natriumacetat.

I studien beskrevet i Artikkel II, evaluerte vi bruken av en relativt enkel, LPMO-rik enzymblanding produsert av soppen Thermoascus aurantiacus i sakkarifiseringen av forbehandlet lignocellulose, og viste at denne blandingen presterer nesten like godt i sakkarifisering av ligninfattig sulfitt-prosessert gran ved 60°C som det kommersielle cellulasepreparatet Cellic CTec2 ved 50°C. Disse resultatene understreker potensialet til T. aurantiacus som produsent av enzymer for bruk i industrielle bioraffineringsprosesser hvor det å opprettholde høye temperaturer kan være fordelaktig. Tilsetting av H2O2-produserende glukoseoksidase til sakkarifiseringsreaksjonene med Cellic CTec2 viste i tillegg at in situ H2O2 produksjon kan drive LPMO-aktiviteten ved sakkarifisering av ligninfattige substrater. Resultatene oppnådd i denne studien var substratavhengige: ved bruk av et ligninrikt substrat var enzymblandingen fra T. aurantiacus mindre fordelaktig, og tilsetting av glukoseoksidase var uheldig for sakkarifiseringseffektiviteten til Cellic CTec2. Disse resultatene fremhever viktigheten av å tilpasse prosessbetingelsene til individuelle lignocellulosesubstrater og enzympreparater.

Artikkel III og IV beskriver den funksjonelle karakteriseringen av AA9 LPMOer. I Artikkel III demonstrerte vi C4-oksideringsaktiviteten til ScLPMO9A fra Schizophyllum commune på en rekke hemicelluloser og løselige cello-oligomer-substrater, inkludert cellotetraose og celloheksaose (med tilsynelatende -3 – +3 binding), og enzymets sterke peroksygenaseaktivitet på løselige og uløselige amorfe substrater. I motsetning til den tradisjonelt antatte rollen til LPMOer i depolymeriseringen av krystallinske substrater, ser ScLPMO9A ut til å ha liten til ingen aktivitet på krystallisk cellulose. Selv om videre undersøkelser av disse observasjonene er nødvendig, inkludert bestemmelse av mulige aminosyrer i det aktive setet som kan bidra til de observerte substratpreferansene, er disse resultatene interessante og kan gi innsikt i LPMOers hittil ukjente biologiske roller. Forskningen presentert i Artikkel IV avdekket aktivitet på glukuronoxylan for to LPMOer fra Neurospora crassa. Ved kvantifisering av oksiderte produkter fra cellulose og xylan, demonstrerte denne studien at foretrukket kløyving av xylan eller cellulose i en blanding av disse to polysakkaridene kan variere betydelig mellom xylan-aktive LPMOer, noe som antyder at disse LPMOene kan ha utviklet seg til å virke på ulike co-polymeriske strukturer i plantebiomasse. Fylogenetisk analyse og modellering av strukturer gjorde det også mulig å identifisere andre mulige xylan-aktive LPMOer.

Resultatene rapportert i denne avhandlingen gir utvidet kunnskap om vår forståelse av LPMO-aktivitet og hvordan best bruke dette i nåværende og fremtidige akademiske og industrielle anvendelser.