Kefir and kefir grains : diversity of chemical properties and microflora

Abstract

Kefir grains contain bacteria and yeasts embedded in a protein and polysaccharide matrix. They constitute the primary starter culture for kefir, a fermented milk drink with a complex sensory profile containing high amounts of lactic acid, ethanol, CO2, acetaldehyde and diacetyl. In commercial production of kefir in Norway, seven kefir grain cultures of Russian and Romanian origin are used in combination. These kefir grain cultures are subcultured several times every week, and have been treated similarly, yet separately for more than 50 years. Consequently, they constitute a unique material for investigations of treatment influence on microbiota, and microflora investigations were performed using a polyphasic approach of culture-dependent and –independent microbiological methods. Enumeration on selective growth media showed that lactococci, lactobacilli and yeasts were all found in similar amounts in all kefir grain cultures, log 7.9±0.1, log 7.7±0.2, and log 7.6±0.1 cfu g-1 of kefir grain, respectively. Using culture-independent microbiology methods, it was shown that the dominant microflora in all seven kefir grain cultures were the same, consisting of Lactobacillus (Lb.) kefiranofaciens, Kluyveromyces marxianus and Kazachstania spp. 16S rRNA gene sequencing of 245 bacteria isolates demonstrated in addition the presence of a secondary microflora mainly consisting of lactic acid bacteria, and whose composition varied somewhat between the different kefir grain cultures. Bacterial isolates found to belong to the same species of lactic acid bacteria were strain typed by rep-PCR. The results showed no correlation between rep-PCR phylogroups and kefir grain culture, however, a strong correlation was found between the phylogroups and the growth medium used for isolation. In the commercial production of large volumes of kefir, direct fermentation with kefir grains is impractical as this would demand a correspondingly large quantity of grains. In addition, it would give a product with a disrupted gel and a bulging carton due to high production of CO2. A stepwise fermentation process is therefore employed, in which the kefir grain fermentate is used for production of a bulk starter. as starter for further inoculations. Kefir grain fermentate and the final kefir commercial product were analysed for microbial content and composition. In the fresh fermented kefir, lactococci and lactobacilli were both present in levels of log 8 cfu mL-1, whereas yeasts were present in lower amounts of log 3.3 cfu mL-1. After 4 weeks of storage, lactococci and lactobacilli showed significant decrease (P<0.01) by 2 and 3 log units, respectively, and remained at this level also after 8 weeks of storage. Conversely, yeast numbers continuously increased during storage, reaching log 5 cfu mL-1 after 8 weeks of refrigerated storage. By analyses of total DNA of the fermentates, Lactococcus lactis was found both in kefir and kefir grain fermentates, and in addition Lb. rhamnosus, Lb. kefiri and Leuconostoc spp. could be demonstrated in kefir. None of the fermentates formed detectable amounts of PCR products when using yeast primers. To reduce the sequencing load when employing denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) for microbial community investigations of dairy products, an additional approach of identification was proposed. By use of high-resolution melt (HMR) analysis and comparison of DGGE band melting profiles to those of known reference strains, rapid species-level identification of lactic acid bacteria can be achieved. It was of interest to investigate whether kefir grains could be replaced by a pure culture starter of lactic acid bacteria and yeast isolates therefrom. The products of single- and co-culture inoculums of microbial isolates from kefir grains incubated in milk were analysed with emphasis on aromatic volatile compounds, organic acids and carbohydrates. The inoculum compositions were of proportions corresponding to the amounts earlier determined to be present in kefir grains. The results showed that the metabolite profiles of the kefir and kefir grain fermentates contained significantly more aroma- and flavour contributing components than the single- and co-culture fermentates, underlining the crucial role of kefir grains for the manufacure of authentic kefir. Assessment of free amino acids content in kefir during regfrigerated storage showed reduction of glutamic acid during storage, and a consequent increase in its decarboxylation product γ- aminobutyric acid (GABA). GABA has earlier been found to have blood-pressure-lowering effect in mild hypertensives when consumed in fermented milk in amounts of 10 mg daily over a 12-week period. After two weeks of storage, the amount of kefir necessary for a 10 mg intake of GABA would be 220 g.

Kefirkorn inneholder bakterier og gjær omsluttet av en matriks bestående av proteiner og polysakkarider. Kefirkorn er starterkulturen for produksjonen av kefir, en fermentert melkedrikk med kompleks sensorisk profil og høyt innhold av melkesyre, etanol, CO2, acetaldehyd og diacetyl. I kommersiell kefirproduksjon i Norge benyttes det en kombinasjon av syv kefirkornkulturer med opprinnelse i Russland og Romania. Disse kulturene podes om flere ganger i uken, og har blitt behandlet likt, men samtidig separat i mer enn 50 år. De utgjør derfor et unikt materiale for studier av behandlingsmåtens innvirkning på mikrofloraen. Undersøkelser av den mikrobielle sammensetningen ble gjort ved hjelp av en flersidet tilnærming ved bruk av både vekstavhengige og –uavhengige mikrobiologimetoder. Vekstforsøk på selektive vekstmedier viste at laktobasiller, laktokokker og gjær var tilstede i omtrent like mengder, henholdsvis log 7.9±0.1, log 7.7±0.2 og log 7.6±0.1 kde g-1 kefirkorn. Ved bruk av vekstuavhengige mikrobiologimetoder ble det vist at den dominerende mikrofloraen var lik i alle syv kefirkornkulturer og bestod av Lactobacillus (Lb.) kefiranofaciens, Kluyveromyces marxianus og Kazachstania spp. Sekvensering av 16S rRNA-genet i 245 bakterieisolater påviste tilstedeværelse også av en sekundærflora, i hovedsak bestående av melkesyrebakterier. Sammensetningen av sekundærfloraen varierte noe mellom kefirkornkulturene. Stammetyping ved hjelp av rep-PCR av bakterieisolater funnet å tilhøre samme art av melkesyrebakterie viste sterk korrelasjon mellom fylogruppene og vekstmediet benyttet under isoleringen, mens ingen korrelasjon ble funnet mellom phylogruppene og kefirkornkulturene. Direkte fermentering med kefirkorn er upraktisk i kommersiell produksjon av store volum kefir på grunn av den store mengden kefirkorn det ville kreve. I tillegg ville det gi et produkt med ødelagt gel og bulende forpakning på grunn av høy CO2-produksjon. Det benytters derfor en stegvis fermenteringsprosess, hvor kefirkornfermentatet brukes som brukssyre i videre syrninger. Kefirkornfermentat og det endelige kommersielle kefirproduktet ble analysert med hensyn på mikrobielt innhold og sammensetning. I fersk kefir var både laktokokker og laktobasiller tilstede i mengder på log 8 kde mL-1, mens gjær ble funnet i lavere mengder på log 3.3 kde mL-1. Etter fire ukers lagring minket mengden laktokokker og laktobasiller signifikant (P<0.01) med henholdsvis 2 og 3 log-enheter, og holdt seg på dette nivået også etter 8 ukers lagring. Gjærmengden økte kontinuerlig gjennom lagringsperioden, til log 5 kde mL-1 etter åtte ukers kald lagring. Analyser av total-DNA fra fermentatene påviste tilstedeværelse av Lactococcus lactis både i kefirkornfermentatene og i kefir, i tillegg ble Lb. rhamnosus, Lb. kefiri og Leuconostoc spp. funnet i kefir. Ingen av fermentatene produserte påviselige mengder PCR-produkt ved bruk av gjærprimere. For å redusere sekvenseringsbelastningen når denatureringsgradient-gelelektroforese (DGGE) benyttes i undersøkelser av mikrobielle samfunn i meieriprodukter, ble det foreslått en ytterligere mulighet for identifisering. Ved å bruke high-resolution melt (HRM) analyse og sammenligning av smelteprofilen til DGGE-båndene med smelteprofilen til kjente referansestammer, kan rask identifisering av melkesyrebakterier på artsnivå oppnås. Det var av interesse å undersøke om kefirkorn kan erstattes med en starterkultur bestående av renkulturer av melkesyrebakterier og gjær isolert fra kefirkorn. Singel- og co-kulturer av kefirkornisolater ble derfor podet i melk, og fermenteringsproduktene ble analysert med vekt på flyktige aromakomponenter, organiske syrer og karbohydrater. Mengdene i sammensetningen av kulturene var i samsvar med forholdene tidligere påvist i kefirkorn. Resultatene viste at metabolittprofilene til kefir og kefirkornfermentatene inneholdt betydelig mer av aroma- og smakspåvirkende komponenter enn fermentatene fra singel- og co-kulturene, hvilket understreker den avgjørende rollen kefirkorn har i produksjonen av autentisk kefir. Undersøkelser av innholdet av frie aminosyrer i kefir under kjølt lagring viste at glutaminsyre ble redusert under lagring, mens dens dekarboksyleringsprodukt, γ-aminosmørsyre (GABA), økte tilsvarende. GABA har tidligere blitt funnet å ha blodtrykkssenkende effekt på pasienter med mild hypertensjon når den blir konsumert i fermentert melk i mengder på 10 mg daglig over en periode på 12 uker. Etter to ukers lagring var mengden kefir tilstrekkelig for å innta 10 mg GABA 220 g.