Functional insights into novel factors affecting cell division in Gram-positive bacteria

Abstract

The opportunistic pathogen Staphylococcus aureus is a major contributor to a range of different infections in human and animals that have become difficult to treat because of the rise of antibiotic resistant strains. New antibacterial strategies are therefore needed. Processes related to bacterial multiplication and cell integrity are attractive therapeutic targets since these involves proteins and mechanisms that are essential for the bacterium. Detailed understanding of such processes, as well as genetic tools to study them, is therefore needed to facilitate development of new combat strategies. The work in this thesis contributed (i) to identify and elucidate the role and importance of novel cell division factors in spherical-shaped S. aureus (ii) to understanding the functional conservation of these cell division factors in bacterial species with other cell shapes (oval-shaped Streptococcus pneumoniae and rod-shaped Lactobacillus plantarum) and (iii) to develop CRISPR interference (CRISPRi) systems for controlled knockdown of essential genes in S. aureus and Lactobacillus plantarum.

In Paper I and II, the membrane proteins CozEa and CozEb in S. aureus were studied. CozEa and CozEb were identified as putative cell division factors in Paper I due to their homology to the S. pneumoniae elongation factor CozE (coordinator of zonal elongation). Staphylococcal cells do not elongate in the same manner, so we were encouraged to investigate their function in spherical S. aureus. Since a double deletion mutant of the CozE proteins was lethal, we developed and utilized a CRISPRi tool to show that the CozE proteins mediate cell division control, possibly through interactions with the early cell division protein EzrA. We also showed that the CozE-EzrA interaction was conserved in S. pneumoniae and that the staphylococcal CozE proteins could complement the cozE deletion phenotype of S. pneumoniae. By further investigating the functions of these proteins in Paper II, we found that the CozE proteins have a functional link to the biosynthesis of staphylococcal lipoteichoic acids (LTA), and that CozEb is involved in control of LTA polymer length. Defects in the LTA biosynthesis pathway and altered LTA length have previously been shown to produce enlarged cells and septum formation abnormalities in S. aureus. Together, the results in Paper I and II, demonstrate that the CozE proteins affect this interplay between LTA biosynthesis and cell division.

In Paper III, we performed a subcellular localization- and gene knockdown screen of essential staphylococcal proteins with unknown function in an attempt to identify novel factors affecting the cell cycle of S. aureus. A gene with locus tag SAOUHSC_01908 was selected for further studies based on its observed subcellular localization and cell division defects upon depletion. This protein, named staphylococcal morphology determinant A (SmdA), was shown to be essential for proper cell morphology maintenance during cell division, by affecting several stages of the cell division process. Notably, the knockdown of the protein also increased the sensitivity of resistant S. aureus to cell wall targeting antibiotics, and in particular β-lactams.

Finally, in Paper IV, L. plantarum was developed as a model to study cell division factors in rod-shaped, Gram-positive bacteria. L. plantarum has been extensively studied for its potential as a probiotic, and as a delivery vehicle of antigens and other therapeutic molecules, but increased knowledge about essential processes in this bacterium is needed for further strain improvements. A CRISPRi system was constructed as a new genetic tool for studies of essential genes. By using this CRISPRi system, phenotypes resulting from knockdown of established cell cycle factors (dnaA, ezrA, acm2) were reported and used to demonstrate the functionality of the system. We show that the CozE homologs in L. plantarum are non-essential and not involved in cell elongation or -division in this species. On the other hand, the recently discovered pneumococcal EloR and KhpA proteins are important for cell elongation in this bacterium.

Den opportunistiske patogene bakterien Staphylococcus aureus forårsaker en rekke ulike infeksjoner i mennesker og dyr som har blitt vanskelige å behandle på grunn av spredningen av antibiotikaresistente stammer. Det er derfor et behov for nye antibakterielle strategier. Proteiner og mekanismer som påvirker celledeling og celleintegritet er essensielle for at bakterien skal overleve, og er derfor attraktive angrepspunkter for antibiotika. Detaljert forståelse av slike prosesser, så vel som genetiske verktøy for å studere dem, er derfor nødvendig for å tilrettelegge for utviklingen av nye strategier. Arbeidet i denne oppgaven har bidratt med (i) å identifisere og belyse funksjonen til nye celledelingsfaktorer i den kokkformede bakterien S. aureus, (ii) å forstå hvordan funksjonen til disse celledelingsfaktorene er konservert i bakteriearter med andre fasonger (den ovalformede Streptococcus pneumoniae og den stavformede Lactobacillus plantarum), og (iii) å utvikle CRISPR interferens (CRISPRi)-systemer for kontrollert nedregulering av essensielle gener i S. aureus og L. plantarum.

I Artikkel I og II ble membranproteinene CozEa og CozEb studert i S. aureus. CozEa og CozEb ble identifisert som antatte celledelingsfaktorer i Artikkel I på grunn av deres homologi til S. pneumoniae sin elongeringsfaktor CozE («coordinator of zonal elongation», koordinator av lateral forlengelse av cellen). Siden stafylokokkceller er runde, forlenger de seg ikke på samme måte som ovalformede streptokokkceller, så vi ønsket derfor å undersøke hvilken funksjon CozE har i S. aureus. Det var ikke mulig å fjerne begge cozE genene samtidig i S. aureus. Derfor utviklet vi et CRISPRi-verktøy og brukte dette til å vise at CozE-proteinene er involvert i kontroll av celledelingen i S. aureus. Dette skjer muligens via interaksjoner med det tidlige celledelingsproteinet EzrA. Vi viser også at denne CozE-EzrA interaksjonen er konservert i S. pneumoniae, og at CozE-proteinene fra stafylokokker kan komplementere cozE delesjonsfenotypen i S. pneumoniae. Ved å videre undersøke funksjonene av disse proteinene i Artikkel II, fant vi ut at CozE-proteinene har en funksjonell kobling til biosyntesen av stafylokokker sin lipoteikoinsyre («lipoteichoic acids», LTA, anionisk overflatepolymer som er festet i membranen). Spesifikt ble det vist at CozEb er involvert i lengdekontroll av LTA-polymerene. Defekter i biosyntesen av LTA, samt forandringer i lengden av LTA, har tidligere blitt vist å føre til forstørrede celler og unormale septumdannelser i S. aureus. Til sammen viser resultatene i Artikkel I og II at CozE-proteinene påvirker dette samspillet mellom biosyntesen av LTA og celledeling.

I Artikkel III utførte vi en subcellulær lokaliserings- og nedreguleringsscreen av essensielle stafylokokkproteiner med ukjent funksjon, i et forsøk på å identifisere nye faktorer som påvirker cellesyklusen til S. aureus. Et gen, med lokusnavn SAOUHSC_01908, ble valgt ut til videre studier fordi dette proteinet lokaliserte til septum av cellen, og klare celledelingsdefekter ble observert ved nedregulering av genuttrykket. Dette proteinet, som vi her kaller SmdA («staphylococcal morphology determinant A»), ble vist å være essensielt for riktig cellemorfologi gjennom påvirkning av flere steg i celledelingsprosessen. Særlig interessant var det at nedregulering av dette proteinet medførte økt sensitivitet mot antibiotika som angriper celleveggen i S. aureus. Spesielt ble methicillinresistente stafylokokker vist å bli mer sensitive for betalaktamer.

Til slutt, i Artikkel IV, ble L. plantarum utviklet som en modell for å studere celledelingsfaktorer i stavformede, Gram-positive bakterier. L. plantarum har blitt forsket mye på for dens potensial som probiotikum og som leveringsvektor for antigener og andre terapeutiske molekyler. Likevel vil økt kunnskap om essensielle prosesser i denne bakterien være viktig for videre forbedring av aktuelle bakteriestammer. Et CRISPRi-system ble konstruert som et nytt genetisk verktøy for studier av essensielle gener i denne bakterien. Ved å bruke dette systemet viste vi fenotyper fra nedregulering av kjente cellesyklusfaktorer (dnaA, ezrA, acm2), for å demonstrere funksjonaliteten av nedreguleringssystemet. Vi viste også at CozE-homologene i L. plantarum ikke er essensielle eller involvert i celleforlengelse eller -deling i denne bakteriearten. Derimot ble to andre nylig karakteriserte elongeringsfaktorer hos S. pneumoniae, EloR og KhpA, vist å være viktige for celleforlengelse i denne bakterien også.