Studies of molecular determinants of virulence in Aliivibrio salmonicida and Vibrio anguillarum

Abstract

The arsenal of virulence factors possessed by a bacterium can determine its ability to infect the host and cause disease. Chitinases and chitin-active lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) have been indicated to play an important role not only in chitin degradation- but also virulence. The genome of Aliivibrio salmonicida, the causative agent of a cold-water vibriosis (CWV) in farmed salmonids, has gone through a substantial gene decay, possibly adapting the bacteria to its pathogenic lifestyle. One of the most affected pathways is the chitinolytic pathway, which is responsible for obtaining nutrients from chitin. Intrestingly, two LPMO and one chitinase encoding genes remain intact. A major part of this PhD project was therefore aimed at investigating whether the chitinase (AsChi18A) and LPMOs (AsLPMO10A and AsLPMO10B) of Al. salmonicida in fact could depolymerize chitin and determine if these enzymes play a role in the pathogenic properties of the bacterium. In the first study, Al. salmonicida was found to be able to utilize chitin as nutrient source, a finding supported by biochemical evidence showing chitin depolymerizing activities for both LPMOs and the chitinase. Investigation of gene deletion variants showed that all three enzymes were required for optimal chitin degradation by the bacterium, although the chitinase was playing the most important role. Interestingly, the chitinase displayed approximately 50-fold lower chitin degrading activity compared to chitinases that were obtained from other well know chitin degrading bacteria, which might indicate the putative adaption of the bacterium to other substrates. Finally, proteomic analysis of chitin catabolism by Al. salmonicida showed that AsLPMO10A was abundantly expressed under all examined conditions including presence of glucose, whereas AsLPMO10B and the chitinase were mostly detected during growth on chitin. The second study investigated the potential roles of AsLPMO10A and AsLPMO10B as virulence factors. In vivo challenge experiments showed that the two LPMOs promoted the virulence properties of the bacterium during the invasive phase of CWV. Intriguinly, exposure of the single and double LPMO-deletion variants to Atlantic salmon serum showed alternation of A. salmonicida proteome response compared to the wild type. This further indicates the use of alternative mechanisms for adaption by the bacterium to the host-mimicking conditions upon deletion of the LPMOs. The final study of the thesis was performed on another bacterium causing vibriosis, namely Vibrio anguillarum. Using comparative label-free quantitative proteomics, the response of the bacterium was analyzed after exposure to several virosisassociated stress conditions like iron-deprivation, hydrogen peroxide (oxidative stress) and innate immune components (Atlantic salmon serum). Most notably, all stress conditions resulted in significant modulation of metabolic pathways and particular virulence determinants. Taken together, the findings of this thesis provide novel insight into the ecology and virulence properties of chitinolytic enzymes in Al. salmonicida and the global proteomic adaptions of V. anguillarum to several vibriosis associated stressors.

Arsenalet av virulensfaktorer tilgjengelig for en bakterie spiller en viktig rolle for evnen den har til å infisere verten og forårsake sykdom. Kitinaser og kitin-aktive lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMOer) er indikert til å spille en viktig rolle i nedbryting av kitin, men også som virulensfaktorer. Genomet til Aliivibrio salmonicida, som forårsaker kaldtvannsvibriose (CWV) hos oppdrettslaks, har gjennomgått et betydelig genforfall. Genforfallet er muligens en tilpasning av bakterien til dens patogene livsstil. En rekke av de ødelagte genene er ansvarlig for å skaffe næringstoffer fra kitin, hvilket kan tyde på at bakterien har mistet evnen til å nyttegjøre seg av kitin som næringskilde. Til tross for dette, er to LPMOkodende gener og et kitinase-kodene gen intakte. Det kan ergo tenkes at disse enzymene kan ha andre roller enn nedbrytning av kitin. En stor del av dette PhDprosjektet ble derfor rettet mot å undersøke om kitinasen (AsChi18A) og LPMOene (AsLPMO10A og AsLPMO10B) til Al. salmonicida kunne depolymerisere kitin, og om disse enzymene kunne spille en rolle for de patogene egenskapene til bakterien.

Den første studien avslørte at Al. salmonicida kan bruke kitin som næringskilde. Funnet ble støttet av biokjemiske bevis som viste at både kitinasen og LPMOene har depolymeriserene aktiviteter. Bruk av genedelesjonsvarianter viste at alle tre enzymene var nødvendige for optimal kitin-nedbrytning, og at kitinasen spilte den viktigste rollen. Videre hadde kitinasen 50 ganger lavere kitin-nedbrytende aktivitet sammenlignet med kitinaser fra velkjente kitin-nedbrytende bakterier, noe som kunne indikere en tilpasning til andre substrater. Ved bruk av proteomisk analyse av Al. salmonicida, ble AsLPMO10A funnet rikelig uttrykt i alle testede forhold (også under vekst på glukose), mens AsLPMO10B og kitinasen omtrent bare ble påvist under vekst på kitin.

Den andre studien undersøkte AsLPMO10A og AsLPMO10B som potensielle virulensfaktorer. Smitteforsøk med Atlantisk laks viste at LPMOene fremmet virulens hos Al. salmonicida, og at dette var knyttet til det invasive stadiet av CWV. Videre viste eksponering av de ulike delesjonsvarientene for lakseserum, forskjellig proteomisk respons sammenlignet med villtypen, noe som indikerer bruk av alternative mekanismer for tilpasning til vertsbetingelser i fravær av LPMOene.

Den siste studien ble utført på Vibrio anguillarum, en annen bakterie som forårsaker vibriose. Ved bruk av komparativ proteomikk ble bakteriens respons analysert etter eksponering for miljømessige stressforhold som jernmangel, hydogenperoksid (oksidativt stress) og serum fra Atlantisk laks. Alle stressforhold førte til signifikant modulering av metabolisme og spesifikke virulensfaktorer.

Funnene i dette prosjektet gir ny innsikt i økologien og virulensegenskapene knyttet til Al. salmonicida’s kitinolytiske enzymer, og gir ny innsikt i V. anguillarum’s globale proteomiske tilpasning til uilke vibriose-assosierte stressfaktorer.