Thermodynamic aspects of processive enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharides

Abstract

Carbohydrates play diverse, essential roles in all known organisms. These include roles in storage and structure as well as specific signaling roles. One carbohydrate can be linked to other carbohydrates or functional groups, through glycosidic linkages. The hydrolysis of these linkages is catalyzed by glycoside hydrolases (GHs), which have specific functions in carbohydrates’ degradation. They may have endo-activity, cleaving the polymer chains at random positions, or exo-activity, preferentially cleaving from either the reducing or nonreducing end of the substrate. These features may be accompanied by either processive or non-processive action. Processive enzymes hydrolyze a series of glycosidic linkages along the same polymer chain before dissociation. The non-soluble polysaccharides chitin and cellulose are the two most abundant biopolymers in nature, with estimated production rates of 100 billion and one trillion tons per year, respectively. Chitin consists of chains of β-1,4-linked N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) units while cellulose is composed of β-1,4-linked glucose units. In both cases successive units are rotated 180 ° relative to each other, thus the structural unit is a disaccharide. Despite the vast amounts produced, they do not accumulate in nature because specialized GHs, namely chitinases and cellulases, depolymerize them. The chitinolytic machinery of the Gram-negative soil bacterium Serratia marcescens has often been used as a model system for enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharides. It consists of two processive exo-chitinases (Chitinase A (ChiA) and Chitinase B (ChiB)), one non-processive endo-acting chitinase (Chitinase C (ChiC), an N-acetyl-hexosaminidase, and an accessory lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) called CBP21. The overall goal of the work described in this thesis was to gain a deeper understanding of how substrates bind to chitinases, thereby improving understanding of how recalcitrant polysaccharides are efficiently degraded. To obtain such understanding, the main objectives were to determine the energetic and kinetic contributions of wild type enzymes and key residues in substrate binding. The work involved six specific studies that are described in detail in appended papers, designated Paper I-VI.

Karbohydrater spiller viktige roller for livet på jorden og er essensiell i alle kjente organismer. Dette inkluderer spesifikke roller i signalisering, samt for lagring og struktur. Karbohydrater bindes til hverandre eller funksjonelle grupper via glykosidbindinger. Hydrolysen av disse bindingene katalyseres av Glykosidhydrolaser (GHer) som har spesifikke funksjoner i degradering av karbohydrater. De kan kutte polymerkjeden tilfeldig ved å være endoaktive, eller de kan ha en preferanse for enten den reduserende eller ikkereduserende enden av substratet ved å være exoaktive. Disse egenskapene kan bli ledsaget av prosessiv eller ikke-prosessiv virkemåte. Prosessive enzymer hydrolyserer en rekke glykosidbindinger langs den samme polymerkjeden før de dissosierer. De uløselige polysakkaridene kitin og cellulose er de to biopolymerene med høyest årlig produksjon i naturen. Det produseres henholdsvis 100 milliarder og 1 billion tonn kitin og cellulose. Kitin består av kjeder med β-1,4 linkede N-acetylglukosaminenheter (GlcNAc), mens cellulose er bygget opp av β-1,4 linkede glukoseenheter. I begge tilfeller er de etterfølgende enhetene rotert 180 ° i forhold til hverandre slik at den minste strukturelle enheten er et disakkarid. På tross av de store mengdene som produseres akkumuleres ikke kitin og cellulose i naturen fordi spesialiserte GHer, kitinaser og cellulaser, bryter de ned. Det kitinolytiske maskineriet til den Gram-negative jordbakterien Serratia marcescens har ofte blitt benyttet som modellsystem for den enzymatiske degraderingen av vanskelig nedbrytbare polysakkarider. Maskineriet består av to prosessive eksokitinaser (Kitinase A (ChiA) og Kitinase B (ChiB)), en ikke-prosessiv endokitinase (Kitinase C (ChiC)), en kitobiase og et hjelpeprotein i form av en lytisk polysakkarid monooksygenase (LPMO) ved navn CBP21. Det overordnede målet for arbeidet som er beskrevet i denne avhandlingen er å oppnå en dypere forståelse for hvordan substrat binder til kitinaser. Dermed forbedres forståelsen av hvordan vanskelig nedbrytbare polysakkarider effektivt degraderes. For å oppnå denne forståelsen har hovedfokuset i denne avhandlingen vært å bestemme energetiske og kinetiske bidrag som villtype enzymer og nøkkelresiduer har på substratbinding. Arbeidet har involvert seks spesifikke studier som er beskrevet i detalj i vedlagte artikler, benevnt Artikkel I-VI.