The farmed Atlantic salmon (Salmo salar) skin-mucus microbiome : bacterial diversity, mucus degrading potential and putative virulence factors

Abstract

Norway is the main producer and exporter of Atlantic salmon worldwide, representing one of the pillars of the Norwegian economy. Today, about 1.2 million tons of salmonids are produced in Norway and a five-fold increase is estimated for the year 2050. The large-scale production of fish is continuously challenged by maladaptive conditions, which often cause diseases that manifest themselves in the form of economic losses and reduced animal welfare. Skin disorders are one of the problems associated with bacterial diseases and seem to be influenced by the combination of several factors such as the fish health status, the bacteria present and the environmental conditions. Indeed, it is recognized that exposure of fish to stress increases their vulnerability to infectious diseases. In the last two decades, the use of vaccines has drastically diminished disease outbreaks caused by bacteria, nonetheless infectious diseases are still occurring in aquaculture. It is therefore important to increase our understanding of the skin, its associate microbial flora and the interaction between the microbiota and the host. In the present work, several aspects of this complex interaction have been investigated, which are reported in three research papers. In paper I, 16S rRNA gene amplicon sequencing was employed to investigate the composition of the farmed Atlantic salmon skin microbiome before and after netting and transport, which represent common aquaculture practices. A rapid community shift was observed after only 24 hours, suggesting susceptibility of the skin-mucus microbiome to external events within a short period of time. The composition of the bacterial community present in the rearing water was also investigated, showing low correlation with the mucus microbiome. Thus, despite the skin-mucus microbiome is in direct contact with the surrounding environment, it seems to be specifically adapted to the mucosal surface. In paper II, label-free quantitative mass spectrometry was used to study the skin-mucus exoproteome associated with both the host (farmed Atlantic salmon) and its bacterial community. The host skin-mucus exoproteome was dominated by host proteins, where many were related to antibacterial activities. By allowing the resident skin-mucus bacteria to grow in the mucus over a period of 9 days, we were able to monitor the temporal proteome dynamics and to evaluate the bacterial capacity to utilize mucus components as nutrient source. Host proteins were gradually replaced by bacterial proteins predominantly related to protein degradation and iron acquisition. The majority of the bacterial proteins detected in the present study belonged to the genus Vibrio. In Paper III, Aliivibrio salmonicida enzymes putatively involved in chitin degradation (AsLPMO10A, AsLPMO10B and AsChi18A) were characterized in order to evaluate their possible role as virulence factors in Cold Water Vibriosis, a disease primarily associated with farmed salmon and rainbow trout. The chitinase AsChi18A showed activity towards chitin, although its capacity to depolymerize this substrate was substantially lower compared to the well-studied chitinases from Serratia marcescens and Cellvibrio japonicus. This result suggests that the Aliivibrio salmonicida chitinase may have evolved activity towards other substrates than chitin. The two lytic polysaccharide monooxygenases AsLPMO10A and AsLPMO10B also showed activity towards chitin. All enzymes bound to Atlantic salmon scales, and in particular the chitinase showed strong binding. Nevertheless, none of the enzymes indicated activity towards scales and salmon skin-mucus. In conclusion, the studies described in this PhD project cover a broad experimental palette that provides new insights into the complex host-microbiota interactions on the fish skin. The work described also pinpoints some of the aspects that must be further investigated to better understand the interactions existing between environment, host and microbial community in the salmon skin-mucus in order to improve fish welfare in aquaculture.

Norge er verdens største produsent av oppdrettslaks og oppdrettsnæringen representerer en av bærebjelkene i norsk økonomi. I 2017 ble det produsert omkring 1,2 millioner tonn oppdrettslaks i Norge og det forventes en femdobling av produksjonen mot år 2050. Storskala produksjon av oppdrettslaks er utfordrende, da betingelsene rundt oppdrett kan forårsake sykdom hos laksen og derav gi betydelige økonomiske tap og redusert dyrevelferd. Hudsykdommer representerer ett av problemene som kan forekomme innen lakseoppdrett og utbrudd påvirkes av mange ytre faktorer som for eksempel hvilke mikroorganismene som er tilstede på huden og stressnivået laksen er utsatt for. I løpet av de siste tiårene har utvikling og bruk av vaksiner redusert forekomsten av bakterieinfeksjoner betydelig, men problemet er fremdeles forekommende. Det er derfor viktig å forbedre vår forståelse av hudbarrieren, bakteriefloraen assosiert med huden og interaksjonen mellom verten og bakteriene. I arbeidene presentert i dette doktorgradsprosjektet har flere aspekter innen relasjonen mellom vert og bakterier blitt belyst. Prosjektet har gitt opphav til tre vitenskapelig studier. I den første studien ble 16S rRNA amplicon sekvensering benyttet til å undersøke sammensetningen av bakteriefloraen på laksehuden før og etter hoving og transport, to håndteringsmetoder som er vanlig i bruk innen lakseoppdrett. Analyse av dataene viste at sammensetningen av mikrobiotaen endret seg betydelig i løpet av kun 24 timer etter håndteringen av fisken. Sammensetningen av bakterier i karvannet ble også undersøkt og viste lav korrelasjon med hudbakteriefloraen. Det kan derfor virke som bakteriefloraen på huden er spesifikt tilpasset mukusoverflaten. Den andre studien benyttet merkefri kvantitativ proteomikk til å undersøke eksoproteomet assosiert med hudmukus hos både verten (Atlanterhavslaks) og bakteriefloraen. Eskoproteomet var dominert av proteiner fra verten, hvorav mange var relatert til antimikrobiell aktivitet. Ved å la bakteriefloraen i hudmukusen vokse over ni dager kunne vi også undersøke hvordan eksoproteomet utviklet seg og hvilke strategier bakterien brukte for å benytte mukus som næring for vekst. Proteinene fra verten forsvant gradvis og ble erstattet av bakterielle proteiner som først og fremst var knyttet til proteinnedbrytning og anskaffelse av jern. Majoriteten av proteinene observert tilhørte genuset Vibrio. I den tredje studien gikk nærmere inn på en spesifikk sykdomsbakterie, Aliivibrio salmonicida, som forårsaker kaldtvannsvibriose hos laks. Tre potensielle virulensfaktorer (AsLPMO10A, AsLPMO10B og AsChi18A) med mulig aktivitet mot kitin ble karakterisert biokjemisk. Kitinasen AsChi18A viste aktivitet mot kitin, men var opp til 50 ganger mindre aktiv enn velkjente kitinaser fra jordbakterier som Serratia marcescens og Cellvibrio janonicus. Dette kan tyde på at AsChi18A har utviklet aktivitet mot andre substrater i tillegg til kitin. De to lytisk polysakkarid monooksygenasene (AsLPMO10A og AsLPMO10B) viste også aktivitet mot kitin. Alle enzymene bandt til lakseskjell og spesielt kitinasen bandt sterkt. Ingen av enzymene viste aktivitet mot komplekse substrater som laksehudmukus eller lakseskjell. Alt i alt dekker dette doktorgradsprosjektet et bredt eksperimentelt arbeid som gir innsyn flere forskjellige fasetter av forholdet mellom lakshuden og bakteriene som finnes der. Arbeidet belyser også en rekke områder som krever dypere forskning for å øke forståelsen av interaksjonen mellom miljø, vert og det mikrobiota på fiskehuden, hvilket er viktig for forbedring av fiskehelse og fiskevelferd innen akvakultur.