Studies on bacteriophages infecting lactic acid bacteria of industrial food fermentations

Abstract

Industrial food fermentations by lactic acid bacteria (LAB) are of great practical and economic importance. Bacteriophages (phages; bacterial viruses) infecting LAB can negatively affect quality, safety and value of the fermented product. This problem is especially pronounced in the dairy industry, where bacteriophages are recognized as the most common cause of fermentation failure. In the study on bacteriophages infecting Lactococcus lactis of starter cultures used in the production of Dutch-type cheese, virulent 936-like phages were identified as the predominant phage group. P335-like prophages were detected but not phages of the c2 group. Bacteriophage biodiversity was assessed by DNA sequencing and a growth inhibition assay employing arrays of starter culture isolates as indicators. Large day-to-day variation in diversity was found within a dairy plant and a peak in the biodiversity coincided with a fermentation failure. The effect of starter culture rotation was reflected by a radical change in phage diversity, but phages infecting the original starter culture rapidly re-emerged. Phage levels in raw milk were low and the phage contamination most probably came from within the plant. The assay used for bacteriophage analyses may have potential for predicting a fermentation failure. Two new bacteriophages were characterized, and their genomes sequenced and analyzed. Bacteriophage Lmd1 represents the first dairy Leuconostoc phage to be characterized on a genomic level. Its closest relative was found to be a Leuconostoc phage, φ1-A4, isolated from sauerkraut fermentation. The two phages share homologous proteins and near complete conservation of gene order in the functional modules involved in replication, packaging and morphogenesis. However, corresponding genes show little conservation at the DNA level. Bacteriophage Lmd1 grows fast and can reach high titers. It was found capable of inhibiting all Leuconostoc isolates of one starter culture, and sensitive leuconostocs were detected in 3 out of 4 commercial starter cultures tested. These results emphasize the importance of including strains with different phage sensitivity in starter cultures and the importance of verifying that starter cultures used in starter culture rotation are unrelated with respect to phage sensitivity. The other bacteriophage characterized in this study, φYS61, was isolated from kimchi, a traditional Korean fermented vegetable product. Phage YS61 belongs to the Podoviridae family and infects Weissella cibaria. It differs from the majority of phages isolated from industrial food fermentations since it is difficult to propagate and very susceptible to resistance development by the host bacterium. Results indicate strongly that φYS61 replicates via a protein-primed mechanism, similar to that of phages belonging to the Picovirinae subfamily, but differences in morphology and genome size led to the conclusion that φYS61 probably represents a new subfamily. This is the first genomic characterization of a phage infecting the genus Weissella. This study has provided deeper understanding of how bacteriophages affect the production of Dutch-type cheese in Norway. Determination of high phage quantities and diversities in the dairy environment and during milk fermentations stresses the importance of stringent hygiene measures, protection of bulk starter milk from contaminating phage and the use of phage-unrelated starter cultures in starter culture rotation. The knowledge gained in this study may also be useful for other industrial fermentations.

Fermentering av næringsmidler ved hjelp av melkesyrebakterier har blitt brukt i årtusener i produksjon av ost, spekepolser, surkål og en lang rekke andre produkter. At fermenteringsprosessen fungerer som den skal er helt avgjørende for kvaliteten, sikkerheten og verdien til sluttproduktet. Bakteriofager (virus som infiserer bakterier) kan hindre riktig fermentering gjennom å drepe essensielle melkesyrebakterier. Dette problemet er særlig utbredt i meieriindustrien der en regner bakteriofager som den viktigste årsaken til fermenteringssvikt. I produksjon av gulost blir starterkulturer som inneholder Lactococcus lactis og bakterier av genus Leuconostoc benyttet til a fermentere melk. Lactococcus lactis er viktig for å danne melkesyre og Leuconostoc for dannelsen av smaksemner. Starterkulturen blir først dyrket opp for å danne brukssyre, eller bulk-starter, og denne blir så brukt til inokulering av melk i ystekarene. En del av denne studien omhandlet bakteriofager som infiserer Lactococcus lactis i norske meierier. Det ble funnet at virulente bakteriofager av typen 936 var dominerende i alle meieriene som ble undersøkt. Ingen virulente bakteriofager ble påvist i kommersielle starterkulturer. Diversiteten av bakteriofager i norske meierier ble kartlagt ved hjelp av DNA sekvensering og gjennom vekstinhiberingsforsøk der bakterieisolater fra starterkulturer ble benyttet til å indikere tilstedeværelse av bakteriofager. Gjennom testing av myse- og brukssyreprøver som ble tatt ut daglig i et meieri, ble det funnet stor variasjon i bakteriofagdiversitet fra dag til dag. En topp i bakteriofagdiversitet sammenfalt med en fermenteringssvikt. Bytte av starterkultur i meieriet forte til en dramatisk endring i bakteriofagsammensetningen i meieriet, men effekten av dette var begrenset siden bakteriofagene som infiserte den originale kulturen raskt vendte tilbake etter at kulturene igjen ble byttet. Bakteriofagnivaene i gardsmelk levert til meieriet var svart lavt og det ble funnet at smittekilden mest sannsynlig er a finne inne i meieriet. I denne studien ble det også karakterisert to nye bakteriofager. Genomene deres ble sekvensert og analysert. Den ene bakteriofagen, φLmd1, infiserer Leuconostoc isolert fra en starterkultur brukt til osteproduksjon. Den nærmeste slektningen til φLmd1 er φ1-A4, en Leuconostoc-bakteriofag isolert fra surkålproduksjon. Bakteriofag Lmd1 hemmet veksten til samtlige Leuconostoc-isolater fra en starterkultur og den var i stand til å vokse på 3 av de 4 starterkulturene som ble testet. Dette viser at det er viktig å inkludere bakteriestammer med ulik bakteriofagsensitivitet i starterkulturer, samt viktigheten av å teste at ulike starterkulturer som skal benyttes til starterkulturrotasjon ikke er følsomme for de samme bakteriofagene. Den andre bakteriofagen som ble karakterisert, φYS61, ble isolert fra kimchi, en tradisjonell koreansk rett som lages gjennom fermentering av grønnsaker. Bakteriofagen tilhører familien Podoviridae og vertsbakterien dens er Weissella cibaria. Den skiller seg ut fra andre bakteriofager isolert fra industriell næringsmiddelfermentering siden den svært hyppig gir resistensdannelse hos vertsbakterien. Det ble funnet at φYS61 mest sannsynlig har proteiner kovalent knyttet til endene av genomet, og at disse benyttes til igangsetting av DNA-replikasjon. Denne mekanismen benyttes av bakteriofager tilhørende underart Picovirinae. Bakteriofag YS61 skiller seg fra Picovirinae i morfologi og genomlengde og bør derfor sannsynligvis danne grunnlaget for en ny underart av Podoviridae. Dette arbeidet har fort til en bedre forståelse av hvordan bakteriofager pavirker osteproduksjonen i norske meierier. Resultatene fremhever viktigheten av gode hygienetiltak, streng beskyttelse av brukssyretanken fra bakteriofag-rike deler av meieriet, samt viktigheten av å benytte starterkulturer med ulik bakteriofagfolsomhet når det roteres mellom ulike starterkulturer. Erfaringer fra dette arbeidet vil trolig også være relevant for annen industriell fermentering som er utsatt for bakteriofagangrep.