Characterization of fecal lactic acid bacteria isolated from healthy Ethiopian infants : bacteriocin production and antibiotic suscepebility

Abstract

In this thesis lactic acid bacteria (LAB) were isolated from fecal samples of healthy Ethiopian infants, identified to species level, screened for bacteriocin production and tested for antibiotic susceptibility. Enterococci were also screened for the production of cytolysin and gelatinase. Among 150 LAB isolates, 81 lactobacilli, 54 enterococci and 15 streptococci were identified by 16S rRNA gene sequence analysis. Most of the lactobacilli were obtained from breast-fed infants, while most of the enterococci and the streptococci were from mixed-fed infants. Lactobacillus fermentum, Enterococcus avium and Enterococcus faecalis were the most frequently isolated species. About 10% of the LAB produced bacteriocins. The majority of the producers were enterococci, indicating a higher prevalence of bacteriocin production in enterococci compared to lactobacilli. For some of the bacteriocins, the producers were found to occur in high numbers in fecal samples, suggesting that bacteriocin renders the producers the capacity to outcompete other bacteria. Six new bacteriocins were detected, two of which showed strong activity against pathogenic bacteria and thus were purified and characterized at biochemical and genetic levels. These are a 4288.2 Da pediocin-like bacteriocin (avicin A) and a 3466.55 Da trypsin-resistant, nisin-like lantibiotic bacteriocin (salivaricin D). Avicin A, produced by E. avium strains, is active against the food-borne pathogen Listeria monocytogenes. Sequence analysis showed that avicin A gene was found on a 7 Kb locus that contains genes encoding bacteriocin synthesis, export, immunity and regulation. Avicin A is similar to mundticin KS and enterocin CRL 35, but its locus resembles that of sakacin X. We showed that the production of avicin A is inducible and regulated by a quorum sensing regulatory system. Salivaricin D is produced by S. salivarius isolates which appeared to account for over 60% of the fecal LAB flora of an infant. It is active against the important pathogens S. pyogenes and S. pneumoniae, which cause a wide variety of diseases. Sequence analysis showed that salivaricin D is located on a 16.5 kb locus that consists of genes responsible for its synthesis, modification, export, processing, immunity and regulation. The primary structure and locus of salivaricin D is similar to that of nisin Q. Avicin A and salivaricin D may be potential chemotherapeutic agents that might control infections due to the respective pathogens they inhibit. Moreover, the producing strains may be used as potential probiotic strains in appropriate settings. Avicin A and salivaricin D share some common features that may increase the chance of the two bacteriocins or their producers to be used as chemical or biological control agents (probiotics), respectively. Different patterns of antibiotic susceptibility were observed among the LAB. Nearly all lactobacilli were sensitive to chloramphenicol, erythromycin and tetracycline. Most lactobacilli were resistant to aminoglycosides and vancomycin which is intrinsic. Many enterococci showed resistance mainly to tetracycline which might have been acquired, but ampicillin and vancomycin resistance was almost absent. Multidrug resistance as well as resistance to high level of aminoglycosides was common among the E. faecalis and E. faecium strains. The streptococci were generally susceptible to the antibiotics. These results suggest that transferrable antibiotic resistance is common among the enterococci, but not among the lactobacilli and streptococci. A very low prevalence of cytolysin and gelatinase production was observed among the enterococci, suggesting that infant enterococci may not cause diseases.

I denne avhandlingen ble melkesyrebakterier (LAB) isolert fra fekale prøver av friske etiopiske spedbarn, identifisert til artsnivå, screenet for bacteriocin produksjon og testet for sensitivitet av antibiotika. Enterokokker ble også screenet for produksjon av cytolysin og gelatinase. Blant 150 LAB isolater, ble 81 laktobasiller, 54 enterokokker og 15 streptokokker identifisert ved 16S rRNA gensekvensanalyse. De fleste av laktobasiller ble isolert fra diende spedbarn, mens det meste av enterokokker og streptokokker var fra blandings-matede spedbarn. Rundt 10% av LAB produserte bakteriociner. Flertallet av produsentene var enterokokker, noe som indikerer en høyere prevalens av bacteriocinproduksjon i enterokokker sammenlignet med laktobasiller. For noen av bakteriocinene, ble produsentene funnet oftere i høye tall i fecal prøver, som kan tyde på at bacteriociner øker produsentenes kapasitet til å utkonkurrere andre bakterier. Seks nye bakteriociner ble oppdaget, to av dem viste sterk aktivitet mot sykdomsfremkallende/patogene bakterier og bel derfor renset og karakterisert biokjemisk og genetisk. Disse er et 4288,2 Da pediocin-lignende bacteriocin (avicin A) og en 3466,7 Da trypsinresistent, Nisin-lignende lantibiotisk bacteriocin (salivaricin D). Avicin A, produsert av E. avium stammer, er aktivt mot mat-borne patogen Listeria monocytogenes. Sekvensanalyse viste at avicin A lokuset er 7,5 Kb og inneholder gener som koder for produksjon, eksport, immunitet og regulering av avicin A. Avicin A er lik mundticin KS og enterocin CRL 35, men dens locus minner om Sakacin X. Vi viste at produksjonen av avicin A er induserbar og regulert av et quorum sensing system. Salivaricin D er produsert av S. salivarius isolater som utgjorde over 60% av fekal LAB flora hos et spedbarn. Den er aktiv mot viktige patogener inkludert S. pyogenes og S. pneumoniae som forårsaker en rekke sykdommer. Sekvensanalysen viste at salivaricin D ligger på et 16,5 kb locus som består av gener ansvarlig for produksjon, modifikasjon, eksport, prosessering, immunitet og regulering. Primærstrukturen og av salivaricin D og genlocuset ligner Nisin Q. Avicin A og salivaricin D er potensielle kjemoterapeutika som kan kontrollere infeksjoner av respektive patogener de ble vist å hemme. Videre kan de produserende stammene potensielt brukes som probiotiske stammer i visse betingelser. Avicin A og salivaricin D har noen felles funksjoner som kan fremme muligheten for at de to bakteriocinene eller deres produsenter kan brukes som henholdsvis kjemiske eller biologiske kontrollagenser (probiotika). Ulike mønstre av mottakelighet for antibiotika ble observert blant LAB. Nesten alle lactobacilli var følsomme for kloramfenikol, erytromycin og tetracyklin. De fleste lactobaciller var iboenderesistente mot aminoglykosider og vankomycin. Mange enterokokker viste ervervet tetracyklinresistens, mens resistens mot ampicillin og vankomycin var nesten fraværende. Multiresistens samt resistens mot høye nivåer av aminoglykosider var vanlig blant E. faecalis og E. faecium stammer. Streptokokker var generelt sett antibiotikasensitive. Disse resultatene tyder på at overførbar antibiotikaresistens er utbredt blant enterokokker, men ikke blant laktobasiller og streptokokker. En svært lav prevalens av cytolysin og gelatinase produksjon ble observert blant enterokokker, som kan tyde på at enterokokker fra spedbarn ikke forårsaker sykdommer.