Regulation of energy metabolism in enterococcus faecalis studied by transcriptome, proteome and metabolome approaches

Abstract

Lactic Acid Bacteria (LAB) are widely used as starter culture in food fermentation. Among LAB also pathogenic bacteria are found particular in enterococci and streptococci. Enterococcus faecalis is a gut commensal bacterium but certain isolates have been shown to be pathogenic while others are foodgrade bacteria in LAB fermented food commodities. E. faecalis ferments sugars through different pathways, resulting in homo- or mixed acid fermentation. In homolactic bacteria glucose is converted to lactate in an ATP producing reaction. In mixed acid fermentation, in addition to lactate production, glucose is also converted to acetate, acetoin, formate, ethanol and CO2. However, there is limited information regarding to regulation of the central energy metabolism of E. faecalis. The aim of this work was to extend our knowledge with respect to the central energy metabolism of E. faecalis by employing metabolite, transcriptome and proteome approaches. High performance liquid chromatography and gas chromatography were used for metabolite measurements. DNA microarray technology and two dimensional gel electrophoresis combined with mass spectrometry analysis were used in transcription and protein expression analysis, respectively. Combining these approaches has not been performed in metabolic analysis in E. faecalis and this should give an in-depth understanding about regulation of the central energy metabolism in E. faecalis. This work showed that in absence of ldh (lactate dehydrogenase) gene, E. faecalis metabolizes glucose to ethanol, formate and acetoin. The change from homolactic to mixed acid fermentation affected expression of several genes and proteins mostly involved in energy metabolism. These genes play an important role in the regulatory network controlling energy metabolism in E. faecalis including acetoin production, and NAD+/NADH ratio. Additional studies were carried out in order to investigate the mixed acid fermentation of wild-type E. faecalis in chemostat during steady state and glucose limiting growth. Growth at three different growth rates demonstrated that the bacterium responded differently depending on the growth rate. At the highest dilution rate (D=0.4 h-1) most of the glucose was converted to lactate while at the lowest dilution rate (D=0.05 h-1) it changed towards mixed acids fermentation. Interestingly, increased growth rate induced the transcription of the ldh gene while the amount of Ldh protein was more or less unaffected. The differences in glucose energy metabolism at different growth and pHs between E. faecalis and two other LAB (Streptococcus pyogenes and Lactococcus lactis) and their LDH negative mutants were also investigated. Of note, deletion of the ldh genes hardly affected the growth rate in chemically defined medium under microaerophilic conditions. Furthermore, deletion of ldh affected the ability for utilization of various substrates as a carbon source. The final study explored the effect of ascorbate on growth in the absence of glucose and showed that E. faecalis can grow on ascorbate. In summary, the work presented in this thesis gave new insights in regulation and strengthens our knowledge regarding the metabolic pathways of glucose fermentation through the metabolite analysis, regulation of transcription and protein expression.

Melkesyrebakterier brukes som startkulturer i en rekke ulike gjæringsreaksjoner i forbindelse med produksjon av mat. Enkelte melkesyrebakterier har også evnen til å forårsake sykdom, og dette gjelder spesielt for enterokokker og streptokokker. Enterococcus faecalis er en kommensal tarmbakterie. Likevel finner man innenfor denne arten både patogene isolater såvel som stammer benyttet i fermentering av matvarer. E. faecalis bryter ned sukker gjennom flere ulike veier, med enten melkesyre (homolaktisk gjæring) eller en blanding av syrer (blandet syregjæring) som endeprodukt. Homolaktiske bakterier bryter ned glukose til melkesyre i en reaksjonskjede som produserer ATP. Ved blandet syregjæring av glukose produseres det i tillegg til melkesyre også eddiksyre, acetoin, maursyre, etanol og CO2. Det er imidlertid lite informasjon om reguleringen av energimetabolismen i E. faecalis tilgjengenlig. Målet med arbeidet bak denne avhandlingen har derfor vært å tilegne oss kunnskap om den sentrale energimetabolismen i E. faecalis ved hjelp av ulike metoder for å studere metabolitter, transkriptomet og proteomet. Væskekromatografi og gasskromatografi ble brukt til metabolittmålinger, mens DNA mikromatriseteknologi og to-dimensjonal gelelektroforese kombinert med massespektroskopi ble brukt til henholdsvis transkripsjon- og proteinanalyser. Kombinasjonen av disse metodene har ikke tidligere blitt brukt i metabolske studier av E. faecalis, og vil derfor forhåpentligvis gi en dypere forståelse av overgangen mellom homolaktisk- og blandet syregjæring. Våre studier viser at i fravær av ldh genet, som koder for laktatdehydrogenase, blir glukose brutt med til etanol, maursyre og acetoin. Denne overgangen fra homolaktisk til blandet syregjøring påvirker uttrykket av en rekke gener og proteiner involvert i energimetabolismen. Genene innehar viktige roller i det regulatoriske nettverket som kontrollerer energimetabolismen i E. faecalis, og inkluderer gener involvert i produksjon av acetoin og balansen mellom NAD+/NADH. Videre studier ble også gjort for å undersøke blandet syregjæring i villtype E. faecalis i kjemostat ved likevektstilstand og glukosebegrenset vekst. Vekst ved tre forskjellige veksthastigheter viste av bakterien responderer forskjellig avhengig av veksthastighet. Ved den høyeste fortynningshastigheten (D=0.4 h-1) ble det meste av glukosen omdannet til melkesyre, mens en endring i retning av blandet syrefermentering ble observert ved den laveste fortynningshastigheten (D=0.05 h-1). Interessant nok så førte økt veksthastighet til økt transkripsjon av ldh-genet, men mengden Ldh-protein var tilnærmet uendret. Forskjellene i nedbrytning av glukose ved forskjellige veksthastigheter og ved forskjellig pH mellom E. faecalis og to andre melkesyrebakterier (Streptococcus pyogenes and Lactococcus lactis) ble også undersøkt. Det er her verdt å merke seg at inaktivering av ldh genene hadde liten innvirkning på veksthastigheten til de ulike bakteriene i kjemisk definert medium under mikroaerofile vekstforhold. Inaktiveringen av ldh påvirket også bakterienes evne til å utnytte andre substrater enn glukose som karbonkilde. I det siste arbeidet i avhandlingen ble det vist at E. faecalis i fravær av glukose er istand til å vokse på askorbinsyre. Sett under ett har arbeidet som er presentert i denne avhandlingen, gjennom analyser av metabolitter, transkripsjonregulering og proteinuttrykk, gitt økt innsikt i reguleringen av og styrket vår kjennskap til veiene for nedbrytning av glukose.