A detailed study of substrate positioning in family 18 chitinases

Abstract

Chitin is a linear polymer consisting of β-1,4-linked N-acetyl-glucosamine (GlcNAc; A) units tightly packed in a crystalline structure. It is produced by living organisms in large quantities per year and is a structural component of fungi, insects and crustaceans. A soluble derivative of chitin, chitosan, is obtained by deacetylation of the chitin polymer, resulting in a hetero-polymer consisting of N-acetyl-glucosamine and glucosamine (GlcN; D) units. Despite, the large amounts of chitin produced, it does not accumulate in nature because it is broken down efficiently by a group of enzymes known as chitinases. Chitin turnover is of considerable economic interest, and inhibition of chitinases is a desirable target in the development of fungicides, pesticides and therapeutics. The primary goal of the work described in this thesis was to study the binding of chitin, fragments of chitin (chitooligosaccharides), and chitosan to different chitinases to gain an insight into the mechanisms behind chitin degradation. Papers I and II describe a detailed thermodynamic characterization of binding of Nacetylated chitooligosaccharides and the pseudosaccharide allosamidin to ChitinaseB (ChiB) from Serratia marcescens, providing new insights into the contributory factors of ligand-binding. Remarkably, binding of chitooligosaccharides was found to be driven exclusively by entropy despite several conserved stacking interactions between the ligand and the active site. Paper III describes a study of the role of the conserved tryptophan in subsite −3 and a putative “+3” binding site by comparing how ChitinaseA (ChiA) from Serratia marcescens and its −3 subsite mutant ChiA-W167A interact with chitooligosaccharides and chitosan. The results reported in this paper highlight the importance of Trp167 for ligand binding and suggest there are important interactions between the enzyme and the ligand which have not been studied previously. Humans possess two active and highly conserved family 18 chitinases, acidic mammalian chitinase (AMCase) and chitotriosidase (HCHT), which are believed to be a part of the human immune system. Papers IV and V deal with the productive and non-productive binding of HCHT, and compare preferences of substrate positioning for HCHT and AMCase. The results help to elucidate the mechanisms of ligand binding to human chitinases and have important implications for the future design of AMCase inhibitors. Inhibitor development requires efficient and fast screening methods to identify strongly binding molecules. Paper VI describes a novel method using infrared matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (IR-MALDI MS) for rapid and robust detection of noncovalent complexes, which is a promising tool in the search for efficient chitinase inhibitors.

Kitin er en lineær polymer bestående av β-1,4-linkede N-acetyl-glukosamin (GlcNAc; A) enheter tett pakket i en krystallinsk struktur. Kitin er en viktig strukturell komponent i sopp, insekter og skalldyr og blir produsert i enorme mengder årlig. Kitosan er et vannløslig derivat av kitin som fremstilles ved deacetylering av kitin polymeren til en hetro-polymer bestående av N-acetylglukosamin og glukosamin (GlcN; D) enheter. Til tross for de enorme mengdene kitin som produseres årlig akkumulerer ikke kitin i naturen. Dette skyldes en mengde proteiner som effektivt bryter ned kitin, kjent som kitinaser. Nedbrytning av kitin er av stor økonomisk interesse og inhibering av kitinaser er ønskelig for utvikling av nye fungicider, persticider og medisiner. Målet med dette prosjektet har vært å studere bindingen av kitin, kitin fragmenter (kitooligosakkarider) og kitosan til forskjellige kitinaser for og beder å forstå mekanismene bak nedbrytningen av kitin. Artikkel I og II gir en detaljert termodynamisk karakterisering av bindingen av Nacetylerte kitooligosakkarider og pseudosakkaridet allosamidin til KitinaseB (ChiB) fra Serratia marcescens, noe som gir et nytt innblikk i hvilke faktorer som bidrar til ligand binding. Det ble observert at binding av kitooligosakkarider i all hovedsak ble drevet av entropi, til tross for at flere konserverte interaksjoner mellom liganden og enzymet i det aktive setet. I artikkel III blir betydningen av den konserverte tryptofan i subsete −3 og det antatte ”+3” bindingsetet studert ved å sammenlikne hvordan KitinaseA (ChiA) fra Serratia marcescens og dens subsete −3 mutant ChiA-W167A binder til kitosan og kitooligosakkarider. Resultatene fra dette studiet understreker betydningen til Trp167 når det kommer til binding av ligander og retter ny oppmerksomhet mot interaksjoner mellom enzymet og liganden utenfor det definerte aktive setet. Mennesker har to aktive, svært konserverte familie 18 kitinaser, acidic mammalian chitinase (AMCase) and chitotriosidase (HCHT), som antas å være en del av det humane immun systemet. I artikkel IV og V har vi studert både produktive og ikke-produktive bindinger til HCHT og preferanser for substratbinding er sammenliknet med den for AMCase. Dette gir en ny innsikt i bindings mekanismer hos humane kitinaser og gir verdifull informasjon for videre design av AMCase inhibitorer. Utviklingen av nye inhibitorer krever effektive og raske metoder for screening av molekyler som binder strekt til enzymet. Artikkel VI beskriver en ny metode for rask og robust deteksjon av ikke-kovalente komplekser ved hjelp av infrarød matrix assisert laser desorption ioniserings masse spektrometri (IR-MALDI-MS). Denne metoden har et stort potensial i jakten på effektive kitinase inhibitorer.